Современные технологии тестирования нуклеиновых кислот: основы и принципы метода, основные этапы. ПЦР: аналитическая процедура, приборы, клиническое применение. ПЦР в режиме реального времени.

ПЦР - это метод, имитирующий естественную репликацию ДНК и позволяющий обнаружить единственную специфическую молекулу ДНК в присутствии миллионов других молекул.

- экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

В 1983 году сотрудник фирмы "Cetus" Kary Mullis предложил метод, ставший в дальнейшем известным как ПЦР. Его целью было создание метода, который бы позволил амплифицировать ДНК в ходе многократных последовательных удвоений исходной молекулы ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы. Через 7 лет после опубликования этой идеи, в 1993 г., Маллис получил за неё Нобелевскую премию.

Суть метода заключается в многократном копировании (амплификации) в пробирке определенных участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов. На каждом цикле амплификации синтезированные ранее фрагменты вновь копируются ДНК-полимеразой. Благодаря этому происходит многократное увеличение количества специфических фрагментов ДНК, что значительно упрощает дальнейший анализ.

Общая схема ПЦР

Принцип ПЦР заключается в следующем. Реакционная смесь обычно содержит матричную ДНК, четыре дезоксири-бонуклеозидтрифосфата dATP, dCTP, dGTP и ТТР, Taq-полиме-разу и два синтетических олигодезоксирибонуклеотидных прай-мера длиной 15-30 нуклеотидов, комплементарных участкам противоположных цепей ДНК, фланкирующих исследуемый участок ДНК-матрицы. ПЦР начинается с кратковременного (1-2 мин) прогревания реакционной смеси при ~95°С. При этом происходит плавление цепей ДНК и инактивация примесных белков, которые могут присутствовать в реакционной смеси, если используется недостаточно очищенная ДНК, например, из клинических образцов. Далее реакционную смесь охлаждают до те­пературы отжига праймеров с матричной ДНК (37-65°С). В результате праймеры связываются с комплементарными местами на матрице и с этого момента начинают служить затравками для синтеза Taq-полимеразой новых цепей ДНК, комплементарных каждой из цепей денатурированной матричной ДНК. Для проведения синтеза ДНК в оптимальных для Taq-полимеразы условиях температуру реакционной смеси поднимают до 72°С и при такой температуре проводят элонгацию цепей вновь синтезирующейся ДНК в течение 0,5-2 мин. По окончании стадии синтеза ДНК заканчивается первый цикл ПЦР, после чего проводятся такие же второй, третий и последующие циклы в автоматическом режиме. После завершения третьего цикла уже образуется дискретный продукт ПЦР - фрагмент дцДНК, содержащий на своих 5'-концах последовательности нуклеотидов праймеров. Количество продукта ПЦР в реакционной смеси после завершения каждого цикла удваивается и, следовательно, по мере прохождения реакции экспоненциально возрастает, достигая нескольких микрограммов в реакционной смеси объемом 25-50 мкл. В финале ПЦР содержимое реакционной смеси анализируют с помощью электрофореза в агарозном геле в присутствии бромистого этидия, где продукт реакции выявляется в УФ-свете. Продукт ПЦР можно выделить из агарозного геля в чистом виде и работать с ним как с обычным фрагментом дцДНК, т.е. гидролизовать рестриктазами, клонировать в плазмидных векторах по липким и тупым концам, секвенировать или использовать в качестве зондов при гибридизации.

С помощью ПЦР можно амплифицировать in vitro сегменты ДНК длиной от 0,1 до 5-7 т.п.о. и более, а для получения положительного результата достаточно присутствия в реакционной сме­си одной-двух копий амплифицируемой последовательности нуклеотидов (например, геномной ДНК, содержащейся в одной-двух соматических клетках). При этом теоретически нет необходи­мости в тщательной очистке матрицы, так как большинство находящихся в реакционной смеси белков и ферментов инактивируется в первых же циклах ПЦР и не оказывает влияния на проте­кание реакции при высоких температурах.

Механизм ПЦР

Компоненты реакционной смеси

Для проведения ПЦР необходимо наличие в реакционной смеси ряда компонентов:

1. ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.

2. Два праймера (или несколько – в зависимости от вида ПЦР), комплементарные концам требуемого фрагмента.

3. Термостабильная ДНК-полимераза — фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов — Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие.

4. Дезоксинуклеотидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

5. Ионы Mg²⁺, необходимые для работы полимеразы.

6. Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции — рН, ионную силу раствора. Содержит соли, бычий сывороточный альбумин.

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1 °C. Современные амплификаторы позволяют задавать сложные программы, в том числе с возможностью «горячего старта», Touchdown ПЦР и последующего хранения амплифицированных молекул при 4 °C. Для ПЦР в реальном времени выпускают приборы, оборудованные флуоресцентным детектором. Существуют также приборы с автоматической крышкой и отделением для микропланшет, что позволяет встраивать их в автоматизированные системы.

Обычно при проведении ПЦР выполняется 20—35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий:

1. Денатурация. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96°C

2. Отжиг.

3. Элонгация (синтез).

"Эффект плато".

Следует заметить, что процесс накопления специфических продуктов амплификации по геометрической прогрессии идет лишь ограниченное время, а затем его эффективность критически падает. Это связано с так называемым "эффектом плато". Термин "эффект плато" используют для описания процесса накопления продуктов ПЦР на последних циклах амплификации, когда количество ампликонов достигает 0,3-1 пмолей. В зав-сти от условий и кол-ва циклов реакции амплификации, на момент достижения "эффекта плато" влияют:

1. Использование и истощение компонентов реакции (dNTP, праймеров, исходной ДНК);

2. Сокращение эффективности денатурации двухцепочечных матриц;

3. Неэффективность отжига праймеров;

4. тепловая инактивация и /или уменьшение концентрации фермента;

5. Накопление конечных продуктов реакции (пирофосфата, олигонуклеотидов);

6. Переассоциация продуктов реакции и/или исходных компонентов реакции;

7. Образование неспецифических продуктов, конкурирующих за исходные компоненты реакции со специфическими продуктами.

Чем меньше начальная концентрация ДНК-мишени, тем выше риск выхода реакции на плато. Этот момент может наступить до того, как количество специфических продуктов амплификации будет достаточно, чтобы их можно было проанализировать. Избежать этого позволяют лишь хорошо оптимизированные тест-системы.

Стадии постановки ПЦР:

1. Подготовка пробы биологического материала - Способ выделения ДНК зависит как от вида определяемого возбудителя, так и от вида клинического образца. В случае соскоба эпителиальных клеток, клеточного осадка мочи широкую распространенность получил метод твердофазной сорбции, заключающийся в добавлении лизирующего агента, содержащего раствор гуанидина, сорбции ДНК на сорбенте, многократной отмывки и ресорбции ДНК буферным раствором. В случае обработки сыворотки, плазмы или цельной крови обычно используется метод фенольной экстракции. Метод включает депротеинизацию фенолом/хлороформом с последующим осаждением ДНК (или РНК) этанолом или изо-пропанолом.

2. Амплификация

3. Детекция - Амплифицированный специфический фрагмент ДНК выявляют методом электрофореза в агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Бромистый этидий образует с фрагментами ДНК устойчивое соединение внедрения, проявляющееся в виде светящихся полос при облучении геля УФ-излучением с длиной волны 290-330 нм.

3.1. Метод горизонтального электрофореза (в агарозе)

3.2. Метод вертикального электрофореза (в полиакриламидном геле)

Контроль за прохождением реакции амплификации

Положительные контроли - в электрофоретической дорожке, соответствующей положительному контролю, должна присутствовать оранжевая светящаяся полоса. Ее электрофоретическая подвижность должна соответствовать указанной в инструкции длине ампликона.

Отрицательные контроли - наличие такой полосы в отрицательном контроле свидетельствует о контаминации

Внутренние контроли - В последнее время в коммерческие тест-системы вводят внутренний контроль, дающий на электрофореограмме отдельную полосу. Применение внутреннего контроля позволяет исключить получение ложноотрицательных результатов вследствие присутствия ингибиторов реакции.

Методы ПЦР

Мультипраймерная ПЦР

Под мультипраймерной (мупьтиплексорной) полимеразной цепной ре­акцией принято понимать процесс коамплификации нескольких ДИК-мат­риц в одной реакционной среде с использованием нескольких пар прай­меров, что позволяет проводить скрининг сразу по нескольким инфекци­онным возбудителям, определять одновременно наличие в биопробе ком­плекса факторов вирулентности и резистентности к антибактериальным и противовирусным препарагам, а также исследовать состояние нескольких аллельных генов у эукариотических организмов, включая человека.

Модификации метода полимеразной цепной реакции ОТ-ПЦР

Гнездовая ПЦР (nested PCR)

Механизм простой полимеразной реакции не пригоден для иденти­фикации рибонуклеиновых кислот, так как Таq-полимераза не способна катализировать синтез ДИК на матрице РИК. Вместе с тем хорошо изве­стно, что геномы многих вирусов состоят из молекул рибонуклеиновой кислоты (РИК) и, вследствие этого, идентификация РИК вирусов, таких как вирус гепатита С, прсдставляется актуальной задачей. Практичсски это решается с помощью нескольких приемов.

1. Использование дополнительного фермента - РИК-зависимой ДИК полимеразы- обратной транскриптазы ОТ (RT - reverse transcriptase). Реакция, катализируемая этим ферментом, приводит к образованию од­нонитевых фрагментов ДИК, используемых в дальнейшем в амплифи­кации с помощью Тао-полимеразы.

2. Как уже было отмечено выше, Таq-полимераза не способна катали­зировать процесс обратной траскрипции, то есть сиитез однонитевой ДИК на РНК-матрице.

Одной из распространенных модификаций метода ПЦР является ис­пользование двух пар праймеров, одна из которых способна амплифици­ровать внутренний участок ампликона, полученного после первого ра­унда амплификации с внешней парой праймеров, Существует несколько вариантов применения гнездовой ПЦР в лабораторной диагностике.

1. Согласно первому варианту проводится амплификация (15-30 циклов) с внешней парой праймеров, при этом амплифицируется основной фраг­мент ДИК Далее часть содержимого переносится в новую пробирку, содер­жащую реакционную смесь, в состав которой входит пара праймеров, узна­ющая последовательности, лежащие внутри основного ампликона. Второй раунд амплификации (реамплификации) также составляет 15-30 циклов.

2. Во втором варианте температура отжига внутренней пары прайме­ров подбирается с таким расчетом, чтобы при проведении первого раунда амплификации они не участвовали в реакции. Обычно температура отжи­га праймеров в этом вариаите гнездовой ПЦР подбирается на 1 0-15°С ниже, чем для внешней пары праймеров, Программа амплификации в этом случае состоит из двух программных блоков. После про ведения первого про­граммного блока амплификации температура отжига праймеров для вто­рого раунда задается на 1 О градусов ниже. Это обеспечивает эффективное участие внутренней пары праймеров во втором раунде амплификации.

Применение гнездовой ПЦР имеет свои преимущества и недостатки. Во-первых, это высокая чувствительность методики. Во-вторых, проведение гнездовой амплификации отменяет необходимость исполь­зовать другие методы, подтверждающие специфичность реакции. Кро­ме того, перенос продуктов реакции из одной пробирки В другую су­щественно снижает концентрацию ингибиторов, которые могут при­сутствовать в пробе после выделения нуклеиновых кислот.

Однако несмотря на ощутимые преимущества, перенос ампликона из одной пробирки В другую может приводить к появлению большого количества ложноположительных результатов вследствие перекрест­ной контаминации проб продуктами амплификации.

In Situ ПЦР Метод In Situ (IS)- ПЦР стал активно развиваться в последнее время благодаря тому, что он, в отличие от ПЦР, проводимой В растворе, позволя­ет не только специфически амплифицировать какую-либо последователь­ность дик, но и локализовать ее внутри клетки. Метод характе­ризуется такой же высокой чувствительностью, как и ПЦР, проводимая в растворе (возможность амплификации исходно одной копии ДИК-мише­ни). Способность локализовать специфическую последовательность де­лает IS-ПЦР неоценимым как в исследовании латентных вирусных инфек­ций и экспрессии генов в клетке, так и в оценке эффекта действия новых лекарственных средств на клеточном и молекулярном уровне.

Внутриклеточное обнаружение продуктов ПЦР может осуществлять­ся двумя способами: через опосредованную (непрямую) In Situ гибри­дизацию или прямую детекцию меченых нуклеотидов (например, ди­гоксигенин-ll-дУТФ, флуоресцеин-дУТФ), которые включаются в со­став амплифицируемого продукта в процесс е ПЦР (прямая IS-ПЦР). В непрямом методе гибридизация меченой ДИК-пробы с амп­лифицированным продуктом обеспечивает максимальную специфич­ность при внутриклеточной детекции ПЦР-продуктов.

Мы бы хотели остановиться на некоторых особенностях проведения IS ПЦР. В первую очередь это касается протеолитической обработки гистологических срезов или клеточного монослоя. Высокая концентрация протеолитических ферментов (трипсин, пепсин или протеиназа К), или длительное время инкубации с ними часто приводят к искажению мор­фологической картинЫ препарата низкие концентрации - к недоста­точному протеолизу и, как следствйе этого, к низкой проницаемости клеточной мембраны дЛЯ ПЦР. При проведении IS-ПЦР также учитывается возможность получения как ложноположительных, так и ложноотрица­тельных результатов. Первая группа артефактов ВКЛючает в себя ампли­фикацию неспецифической ДНК в результате ПЦР, неспецифическое включение меченого нуклеотида вследствие репаративных свойств ДНК­полимеразы клетки или используемой в реакции Таq-полимеразы, диф­фузию амплифицированных фрагментов ДНК из клеток. Вторая группа артефактов (ложноотрицательные результаты) особенно характерна дЛЯ IS-ПЦР, выполненной на стекле. Их причина до конца не выяснена, но возможно уменьшение эффективности амплификации обусловлено фи­зическими факторами, такими как недостаточно быстрое охлаждение и нагревание препарата, недостаточная конвекция реагентов под зажима­ми или возможная адсорбция ДНК-полимеразы и других компонентов на поверхности стекла, покрытой специальным агентом. Альтернатив­ное объяснение ложно-отрицательных результатов - это потеря ПЦР-про­дуктов во время промывок препарата при детекции, Чтобы избежать ложноотрицательных и ложноположительных ре­зультатов обычно выполняют следующие контроли: обработка срезов или клеточного монослоя ДНК-азой (отрицательный контроль), прове­дение амплификации ДНК без ДНК-полимеразы; проведение амплифи­кации ДНК без праймеров (контроль ДНК-полимеразной репарации), про ведение процедуры выявления без использования антител, а также без использования щелочной фосфатазы - для регистрации содержания эндогенного биотина и эндогенной активности фермента (если в каче­стве меченого нуклеотида используется биотин -11-дУТФ).

Количественная ПЦР Существует несколько приемов для количественной оценки продуктов амплификации, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки.

Вначале необходимо получить представления о том, какие причины могут влиять на точность измерения ампликонов и что такое количествен­ная ПЦР. Как и любая биохимическая реакция, протекающая in vitro, ПЦР имеет ряд существенных отклонений от теоретически предсказанной за­кономерности накопления продукта, ПРОисходящего не по закону гео­метрической прогрессии, а по сложному закону, обусловленному исто­щением реагирующих компонентов, присутствием ингибиторов, инак­тивацией фет-мента в ходе реакции и т.д. Принять во внимание все эти факторы при расчете калибровочных кривых практически невозможно, поэтому необходимо применение методик, позволяющих учитывать мно­гочисленные параметры в ходе самой ПЦР. Исследователь не может быть до конца уверен в том, что все испытуемые образцы при изначально оди­наковых условиях по реагентам и температуре в термобпоке дают одина­ковый выход продукта. Из вышесказанного следует, что действенным способом борьбы с недостатками ПЦР как метода количественного оп­ределения мишеней амплификации являются методические приемы, по­зволяющие регистрировать протекание реакции или вносить поправки, выявляя возможные артефакты в каждой пробе. Для создания количественной ПЦР наиболее распространены подхо­ды, использующие внутренние контроли- стандарты, которые, как и оп­ределяемая ДНК, участвуют в ПЦР. Используя контроли -стандарты с разным количеством копий на образец, можно определить количество копий матрицы, участвующей в реакции. Внутренний контроль­ стандарт выполняет несколько функций. Во-первых, он позволяет выя­вить возможное ингибирование реакции ингибиторами, содержащимися в выделенном клиническом образце. Во-вторых, использование контро­ля в ходе реакции в той же пробирке, где происходит определение испы­туемой матрицы, позволяет учесть эффект неравномерности протекания реакции, так как условия амплификации стандарта и определяемой ДНК или РНК абсолютно идентичны. В третьих, использование контроля по­зволяет в значительной степени абстрагироваться от изучения законо­мерностей протекания реакции, так как основным алгоритмом опреде­ления является совпадение интенсивности сигнала от внутреннего конт­роля-стандарта и сигнала от определяемого ампликона. Кроме описанного выше метода количественной ПЦР с использова­нием внутреннего контроля на пракгике используется еще один прием, по­лучивший название "метод конечных разведений". cyrь подхода в том, что определяется конечное разведение образца дик или РНК, дающее поло­жительный результат ПЦР. В каждом определении используется панель стан­дартов для выявления чувствительности работы тест-системы. Этот метод не дает реальной возможности контролировать процесс амплификации со всеми его отклонениями от ожидаемого, вместе с тем, техника его наиболее проста в исполнении. Из-за методической простоты некоторые лаборатории до сих пор используют этот метод для так называемых внут­рилабораторных (in house) технологий. Такой подход неприемлем для отечественной лабораторной службы, строго регламентирующей возмож­ность работы только с сертифицированными наборами реагентов.

Область применения метода ПЦР в клинической диагностике:

- ранняя диагностика инфекционных заболеваний у серонегативных пациентов, когда лечение наиболее эффективно;

- выявление персистирующих, латентных и рецидивирующих форм инфекций;

- контроль проведения лечения;

- диагностика оппортунистических инфекций, часто протекающих на фоне иммунодефицита, вследствие чего постановка диагноза только по результатам серологических исследований затруднена, из-за имеющихся несоответствий между параметрами иммунного ответа и течением заболевания;

- уточнение сомнительных результатов серологических исследований;

- эпидемиологические исследования;

- выявление наиболее патогенных штаммов инфекционных агентов;

- исследования инфекционности пулированных образцов крови и ее продуктов, применяемых в клинике;

- определение резистентности к лекарственным препаратам.

Методы ДНК-диагностики незаменимы в пренатальной диагностике наследственных заболеваний (муковисцидоза, фенилкетонурии, гемофилии и пр.), а также при установлении отцовства.