Аналитические основы энзимологических исследований. Правила взятия и хранения биоматериала. Кл-я методов опр-я акт-ти ферментов. Методы выражения энзиматической активности.

Ферментная диагностика используется в 2 главных направлениях:

1) для распознавания наследственных нарушений обмена в-в (первичные насл-е энзимопатии)

2) для диагностики и дифдиагностики приобретенных заболеваний (вторичные приобретенные энзимопатии).

В основе любого пат. процесса лежит нарушение ферментных сис-м. Ферменты позволяют выявить особенность протекания болезни почти на молекулярном уровне.

Обычно опр-т не один какой-то фермент, а несколко ферментов, т.е. ферментный спектр.

Изм-е акт-ти ферментов крови подразделяют на параферментемии (появление в крови ферментов, в норме не встречающихся в ней) и дисферментемии (гиперферментемия – повышение акт-ти фермента, постоянно прис. в плазме крокви; гипоферментемия – понижениеакт-ти фермента).

Основным биолог материалом для исследования активности ферментов является сыворотка.

Кровь берут утром натощак (между 8 и 10 часами), до физ нагрузки и проведения диагност процедур. За сутки до взятия крови исключ алкоголь, после 2 ч ночи исключить курение, прием пищи и жидкости, если для выполнения большинства тестов взятие крови производят после 8-12 ч голодания, то для определения триацилглицеринов требуется выдержать 10-12 часовой интервал после приема пищи.

Следует помнить, что при пребывании человека в течение нескольких часов в горизонтальном положении объем плазмы в русле крови оказывается на 10-15% больше, чем у пациента, сохраняющего обычный двигательный режим. Отсюда концентрация веществ в крови человека, лежавшего в течении более часа, всегда ниже, чем у него же после ходьбы. Положение тела оказывает влияние на концентрацию общего белка, альбумина, креатина, холестерола, триацилглицеринов, активность ЩФ, АСТ и др компонентов плазмы.

При взятии крови из вены время сдавления сосудов жгутом по возможности должно быть минимальным. Больному не следует сжимать и разжимать пальцы, так как это вызывает местный стаз и гипоксию, а также всдвиги в распределении некоторых веществ (холестерола, калия, натрия, кальция и др) между форменными элементами крови и ее жидкой частью. Кровь берут из крупной вены (локтевая) в чистую сухую стеклянную или пластиковую пробирку. Что м. привести к гемолизу – узкий жиаметр иглы, длительный забор крови, интенсивное давление на поршень шприца при выливании крови в пробирку, интенсивное встряхивание и.т.д. Если пациенту проводилась в/в терапия, то кровь берут дальше от места инфуци (из вены другой руки).

При лизисе сосредоточенных в сгустке эр находящиеся в них ферменты переходят в сыворотку крови, этим объясняется более высокая активность энзимов (ЛДГ, АСТ, АЛТ, КФ, содержащихся в значительных количествах в тромбоцитах и эр и освобождающихся из них при свертывании крови) в сыворотке, чем в плазме, поэтому для опред этих ферментов лучше использовать плазму.

Для получения сыворотки антикоагулянт не добавляют. Доставленные пробирки закрытые ватной пробкой, помещают в термостат на 10-15 мин для прогревания, затем осторожно проводят проволокой по внутренней стенке пробирки, чтобы ускорить получение сыворотки, затем центрифугируем.. Пробирку с кровью допускается выдерживать при комнатной темпер в течении 1-1,5 ч после взятия. Снимать плазму (сыворотку)не позже 1 часа. Если сыворотка нужна немедленно, то кровь центрифугируют 15 мин при 1500 об, затем сыворотку в центрифужку и вновь центриф 10 мин.

Обычно сыворотку крови содержат в холодильнике при 0-4 С, допускается ее хранение в течении месяца, если ее заморозить сразу после взятия. Активность ЩФ более стабильна при комнатной температуре. КФ определять только в свежей сыворотке.

Методы определения активности ферментов.

Методы определения активности ферментов могут быть под­разделены на 2 основные группы:

а) колориметрические методы, основанные на инкубации сы­воротки с субстратом в соответствующем буфере в течение опре­деленного времени, по истечении которого ферментативную ре­акцию останавливают и образующиеся продукты определяют при помощи подходящей химической реакции либо замеряют коли­чество оставшегося субстрата;

б) спектрофотометрические методы, с помощью которых не­прерывно или периодически в ходе ферментативной реакции определяют потребление субстрата или кофермента либо образо­вание продукта. Эти методы часто называются кинетическими методами, поскольку измерения каталитической активности за­висят от кинетики непрерывной регистрации реакции. Боль­шинство кинетических методов основаны на оптическом тесте Варбурга с применением пиридинкоферментов (НАД, НАДН₂)'

Ферменты преим-но локализуются внутри клеток, где и проявляется их действие. Поэтому ↑ акт-сти ферментов в плазме (сыв-ке) крови при целом ряде заб-ний связано прежде всего с ↑ проницаемости плазма­т. мембраны, мембран лизосом, некрозом клеток и вы­ходом энзимов из поврежден. органов и тканей в кровь. При этом содерж-е и акт-сть фермента в повреж­ден. органе ↓, а в сыворотке (плазме) крови - ↑. Полагают, что в рез-те общей реакции орг-ма ферменты переходят в плазму не только из поврежд. ор­гана, но также из клеток других органов и тканей, не затронутых патологическим процессом.

Для исследования акт-сти ферментов чаще всего используется плазма или сыворотка крови. В процессе свертыва­ния крови и последующей ретракции сгустка высвобождаются содержащиеся в тромбоцитах БАВ, под влиянием которых возрастает акт-сть многих энзимов. Наб­людаемое в процессе свертывания разрушение форменных эле­ментов (эритроцитов и др.) крови обусловливает дальнейшее увели­чение ферментативной активности, оказывающейся, как правило, в сыворотке более высокой, чем в плазме. Этим, в частности, объясняется и известное предостережение избегать гемолиза крови.

Хранение сыв-ки сопровождается ↓ активности ферментов. Для бол-ва из них активность не изменяется при комнатной температуре в течение ~-8 ч, при 4 оС _ около недели, а в заморож. состоянии - на про­тяжении месяца. При опред. акт-сти фермен­тов в плазме; следует учитывать, что многие антикоа­гулянты способны и'нгибировать энзиматическую деятельность. Известно, что оксалаты подавляют активность ЛДГ, ЭДТА инги­бирует активность кислой и щелочной фосфатаз.