Лабораторная диагностика сахарного диабета. Гликемический профиль. Нагрузочные пробы, тест толерантности к глюкозе.

С изменением уровня секреции и функциональной активности инсулина связывают формирование сахарного диабета. СД имеет две клин формы: инсулинзависимый (1 типа) и инсулиннезависимый (2 типа). ИЗСД возн вследствие абсол снижения содержания инсулина в крови, вызываемого воспалительным процессом (краснуха) стрессовыми реакциями и др. ИНСД в основном у людей, страдающих ожирением, при этом вследствие увеличения конц липопротеинов в крови уменьшается колич рецепторов к инсулину в клетках, изменяется сродство к гормону.

Диагностика сахарного диабета включает следующее:

1. определение уровня глюкозы в крови. Гипергликемия при СД мож быть разной степени выраженности: не более 8,3 ммоль/л (незначительная), достигающая 14 ммоль/л (выраженная) и свыше 14 ммоль/л (резко выраженная). В норме натощак уровень глюкозы составляет 3,5-5,55 ммоль/л. Содержание глюкозы в крови определяется по цветной реакции с ортотолуидином, которые соединяются в комплекс зеленого цвета, интенсивность его образования оценивается колориметрически, и ферментативным методом: глюкоза в присутствии глюкозооксидазы окисляется с образованием перекиси, которая под действием пероксидазы окисляет субстрат с образованием окрашенного продукта, определяемого фотометрически.

2. определение уровня глюкозы в моче. По цветной реакции с ортотолуидином и ферментативным методом. Исследуется суточная проба мочи, т. к. в течение суток глюкоза выделяется неравномерно.

3. для подтверждения диагноза СД используют тесты толерантности к глюкозе.

4. определение гликозилированного гемоглобина методом хроматогр анализа, электрофоретического фракционирования, абсорбционной фотометрии и др.

5. определение альбумина. При неосложненном СД содержание альбумина в моче 12-35 мг/сут. Хорошо известны индикаторные полоски для измерения альбумина в моче. Они основаны на применении красителей, реагирующих на рН. При заданном рН их цвет изменяется в присутствии белков, особенно - альбумина. Преципитационные тесты - осаждение белков сульфосалициловой кислотой (или другими кислотами) или путем коагуляции нагреванием. После охлаждения возникает помутнение, заметное при следовых концентрациях белка (50-200 мг/л) и все более сильное при концентрации белка вплоть до 5000 мг/л. Для диагностики микроальбуминурии в настоящее время чаше всего применяются различные варианты иммунологических методов, когда образование комплекса альбумина со специфическими антителами к нему приводит к появлению светорассеяния. Новый метод, предложенный в 1998 году в Германии, основан на применении специального флуоресцентного зонда АВ-580. Его чувствительность составляет 0,4 мг/л. К пробе мочи добавляют флуоресцентный реактив и сразу измеряют интенсивность флуоресценции.

Для повышения эффективности выявления сахарного диабета Междуна­родный экспертный комитет по диагностике и классификации диабета реко­мендует следующие критерии тестирования на диабет в здоровой популяции (1998г.): возраст более 45 лет (обследование 1 раз в три года), в более раннем возрасте - при ожирении, наследственной отягощенности по диабету, гестаци­онном диабете в анамнезе, рождении ребенка весом более 4,5 кг, гипертонии, гиперлипидемии, выявленной ранее нарушенной толерантности к глюкозе.

Диагностика

Методы лабораторной диагностики. При оценке данных гликемии всегда необходимо знать, каким методом проводилось исследование. Имеется большое количество методов определения глюкозы в крови, но в настоящее время наиболее распространены глюкозооксидазный и метод Сомоджи—-Нельсона.

Глюкозооксидазным методом определяется истинная глюкоза крови, поэтому он является наиболее специфичным. Этот метод основан на использовании энзима — глюкозооксидазы. Нормальной величиной гликемии натощак при определении глюкозоокси-дазным методом считается 60—100 мг%. Метод Сомоджи—Нельсона дает результаты, близкие к этим величинам.

Широко применявшийся ранее метод Хагедорна—Иенсена, основанный на редуцирующих свойствах глюкозы, открывает, креме глюкозы, и другие редуцирующие вещества и дает более высокие результаты. Нормальный уровень сахара крови натощак

по методу Хагедорна—Иенсена составляет 70—120 мг%. Метод Сомоджи—Нельсона также основан на редуцирующих свойствах глюкозы, но при нем не происходит гемолиза, что делает определение более специфичным. В последние годы получило распространение определение глюкозы с помощью автоматических анализаторов.

Для оценки уровня сахара крови имеет значение, какая кровь подверглась исследованию — капиллярная или венозная. Содержание глюкозы в капиллярной крови выше, чем в венозной, и разница может достигать 20—30 мг%. Приведенные выше величины нормальной гликемии относятся к крови, взятой из пальца. Исследование сахара в крови, взятой из пальца, из-за удобства ее получения нашло более широкое распространение, а в СССР используется повсеместно.

Повторно обнаруженная гипергликемия натощак обычно является признаком явного сахарного диабета, хотя иногда может быть следствием эмоционального возбуждения.

Косвенным подтверждением гипергликемии у большинства людей является глюкозурия. Обычно сахар обнаруживается в моче при наличии гликемии около 160—170 мг% 1. На основании обнаружения только глюкозурии диагноз сахарного диабета не может быть поставлен, так как, хотя и редко, глюкозурия может быть следствием понижения порога проходимости почек для сахара.

С другой стороны, глюкозурия может отсутствовать при высоком уровне сахара в крови, достигающем 300 мг% и более (например, у больных с нефросклерозом).

Незначительное содержание глюкозы в моче, неопределяемое общепринятыми методами, является физиологическим и не включается в клиническое понятие «глюкозурия».

Исследование сахара в моче может быть качественным и количественным. Качественные методы с реактивами Бенедикта или Ниландера, в основе которых лежит восстановление соответственно солей меди или висмута, могут, кроме глюкозы, открывать и другие сахара — фруктозу, галактозу, пентозы, лактозу. Ложно положительная реакция при определении сахара в моче этими методами может иметь место за счет камфоры, морфина, салицилатов, пенициллина и других лекарственных веществ Фруктозурия бывает при обильном потреблении фруктов и врожденной непереносимости фруктозы, галакто-зурия — при врожденной галактоземии, лактозурия — при лактации. Эти возможные влияния необходимо учитывать при оценке результатов.

В настоящее время выпускаются реактивные бумажки «глюко-тест» и таблетированные «наборы для экспресс-анализа сахара в моче». Они позволяют довольно точно определить количество сахара в моче. Пользоваться ими очень просто, требуется лишь ознакомление с прилагаемой инструкцией.

Наиболее точная количественная оценка содержания глюкозы в моче достигается при ее определении с помощью поляриметра.

Для определения кетоновых тел в моче в практической работе является достаточным качественный метод, основанный на том, что ацетон и ацетоуксусная кислота при реакции с нитропруссидом натрия в щелочной среде дают фиолетовую окраску. Бета-оксимасляная кислота этой пробой не определяется. Для проведения качественной реакции на ацетон выпускаются таблетки в «наборах для экспресс-анализа ацетона в моче». Ацетопурия у больных сахарным диабетом указывает на тяжелые нарушения обмена, вызванные инсулинной недостаточностью. Ацетопурия может наблюдаться также у здоровых лиц при голодании и у больных, не страдающих сахарным диабетом при некоторых инфекциях, интоксикациях, в том числе токсикозах беременных. Уровень сахара крови при этом нормальный или пониженный.

При подозрении на сахарный диабет назначается исследование мочи и крови на сахар и мочи на ацетон. Моча собирается обычно за сутки, но может быть собрана также лишь за дневное время. Исследование только утренней (после ночного сна) порции мочи нецелесообразно, так как при этом могут быть пропущены легкие формы сахарного диабета, при которых гипергликемия, достаточная для появления сахара в моче, может наблюдаться только в дневное время.

Для установления диагноза явного сахарного диабета необходимо убедиться в том, что глюкозурия обусловлена гипергликемией. При концентрациях глюкозы в крови натощак, незначительно превышающих нормальные величины, необходимы повторные исследования. При возможности определяют также дневные колебания сахара в крови, которые у здоровых людей находятся в пределах 70—140 мг%. Если и при повторных исследованиях содержание глюкозы в крови незначительно превышает нормальные величины или прежний повышенный уровень не подтверждается, то проводится проба на толерантность к глюкозе.

Тесты толерантности к глюкозе (ТТГ). Упрощенный вариант пробы. Определение содержания глюкозы в крови ч/з 2 ч после приема пищи (эквивал-го 75-100 г углеводов) или 75 г глюкозы. Если сахар в крови натощак превышает 6-7 ммоль/л, а после приема глюкозы через два часа - выше или равен 11,1 ммоль/л (дают обычно нагрузку 75 г глюкозы), можно считать, что больной страдает сахарным диабетом. Если сахар в крови натощак не превышает 6 -7 ммоль/л, а после нагрузки глюкозой через два часа колеблется в пределах от 7,8 до 11,1 ммоль/л, то можно говорить о нарушенной толерантности к глюкозе (ранее применяемое название - "скрытый сахарный диабет").

Проба с однократной нагрузкой глюкозой («однократная»). Перорально принимается р-р, сод 75г глюкозы, кровь из пальца берут до нагрузки, ч/з 1 и 2 ч после приема. При сахарном диабете диабетическая кривая хар-ся тем, что гипогликемическая фаза спада за время провед теста отсутствует, нагрузка сопровожд-ся переходом глюкозы в мочу.

Проба с двукратной нагрузкой глюкозой (син. Штауба — Трауготта проба) — метод оценки инкреторной функции поджелудочной железы, заключающийся в двукратном приеме внутрь раствора глюкозы (с интервалом 90 мин.) и определении содержания глюкозы в крови до первого приема и через каждые полчаса в течение последующих трех часов. У здоровых при повторном введении наблюдается значительно меньший подъем глюкозы или его полное отсутствие подъема (положит эффект Штауба — Трауготта), при СД – выраженное возрастание конц глюкозы, как после первой (­­– эффект Штауба — Трауготта).

Применяется в основном для диагностики скрыто протекающего СД.

Среди пациентов с нару­шением толерантности к глюкозе, также как среди больных диабетом, увеличен риск развития инфаркта миокарда и инсульта

ТТГ проводится в том случае, если неясен диагноз. Если же диагноз «са­харный диабет» не вызывает сомнений из клинической картины и повышенного уровня глюкозы натощак или после еды, то проведение ТТГ не показано, так как этот тест не безразличен для функции поджелудочной железы.

34 Лабораторные критерии компенсации сахарного диабета. Клиническое значение определения гликозилированного гемоглобина и фруктозамина.

Эффективность лечения диабета оценивается клинически по предупреж­дению острых и поздних осложнений, лабораторно - полуколичественным оп­ределением концентрации глюкозы в моче, по уровню глюкозы в крови и путем измерения гликированных белков в крови, а также по специфическим тестам наличия осложнений диабета.

Критерии компенсации при СД 1 типа

Параметры	Компенсация	Субкомпенсация	Декомпенсация
НвА1с, %	6-7	7,1-7,5	>7,5
Ур Глюкозы в каппилярной кр	Гликемия натощак	5-6	6,1-6,5	>6,5
ч/з 2 ч после еды	7,5-8	8,1-9	>9
Перед сном	6-7	7,57,1-	>7,5

Критерии компенсации при СД 2 типа

Параметры	Компенсация	Субкомпенсация	Декомпенсация
Гликемия натощак, ммоль/л	4,4-6,1	7,8	7,8
Гликемия после еды, ммоль/л	4,4-8	9,5
НвА1с	6,5	7,5	7,5
Глюкоза мочи,%		0,5	0,5
Триглицериды, ммоль/л	1,7	2,2	2,2
Холестерин, ммоль/л	5,2	6,5	6,5

Большинство контактирующих с глюкозой белков чела и животных подвержены нефермен-ому гликозилированию.

Неферментативное гликозилирование белков (Н.г.б.) — биохимическая реакция присоединения моносахарида к белку и последующие превращения образовавшегося соединения, протекающие без участия ферментов. В организме здорового человека степень Н.г.б. незначительна, но при стойких гипергликемиях его интенсивность резко увеличивается. Содержание в крови несферментативно гликозилированных белков повышается при таких заболеваниях и патологических состояниях, как сахарный диабет, галактоземия, различные мелитурии, атеросклероз и др.

Гликозилированный гемоглобин или гликогемоглобин. В гемолизатах крови человека наряду с основной фракцией гемоглобина (HbA) содержится незначительное количество других фракций, названных “минорными” (НвА1а, А1b, A1c). У здоровых взрослых на долю НвА приходится 90%, НвА1а-1,6%; НвА1в-0,8%, НвА1с-3,6%; НвА2-2,5% и НвF-0,5%. Гликозилированный гемоглобин – это гемоглобин, в котором молекула глюкозы конденсируется с b-концевым валином бета-цепи молекулы НвА. Этот неферментативный процесс протекает медленно, в течение всей жизни эритроцита (около 120 дней). Гликозилирование осуществляется через стадию образования альдимина (“шиффовы основания” между альдегидом углеводов и аминогруппой), сравнительно нестойкого, “обратимого” соединения - ферментативный этап. Далее более длительный этап – перегруппировка Амадори – завершается образованием стабильного кетоаминового соединения. Образовавшийся кетоамин остается присоединенным к белку на весь период его жизни. Гликозилированию подвергаются многие белки организма (белки крови, хрусталика, почек, нервов, сосудов и др.). Скорость гликозилирования и количество гликозилированных белков зависит от величины и длительности гипергликемии. У больных сахарным диабетом уровень гликозилированных белков повышен в 2-3 раза.

HbA1 – это общий гликозилированный гемоглобин (а+b+с), HbA1с – представлен в наибольшем количестве, норма – 5,6-7,5 % от общего сод-ия Hb.

Определение неферментативно гликозилированных белков чрезвычайно важно для практической медицины. Даже однократное определение в крови больного, например, HbA1c дает достоверную характеристику картины гликемии за истекшие 2—3 мес. (срок биологической жизни гемоглобина в кровотоке) – интегральный индекс гликемии. Этот показатель более стабилен, чем показатель концентрации глюкозы в крови, и не подвержен циркадным и случайным колебаниям. По мнению многочисленных исследователей и по рекомендациям ВОЗ, его удобно использовать для распознавания сахарного диабета, особенно его скрытых и лабильных, трудно диагностируемых форм. Определение концентрации в крови неферментативно гликозилированного альбумина — более лабильного, чем HbA1c соединения (срок биологической жизни гликозилированного альбумина в кровотоке около 20 дней), дает возможность успешно контролировать лечение сахарного диабета или другого патологического состояния, характеризующегося высокой гипергликемией. Определение содержания в крови HbA1c или гликозилированных кератинов (в волосах, ногтях) позволяет установить степень вероятности развития осложнений при сахарном диабете или постоянной гипергликемии.

Неферментативное гликозилирование белков во многих случаях приводит к резкому изменению их свойств. Так, подвергшийся неферментативному гликозилированию гемоглобин — гемоглобин А_1с обладает более высоким сродством к кислороду, т.е. с трудом отдает доставленный к тканям кислород. КДЗ: постановка диагноза, контроль за лечением СД, состоянием углеводного обмена.

«Фруктозамины» в клин химии обозначают сумму гликозилированных белков сыворотки крови. Фруктозамины – продукты неферментативной р м/д моносахарами и АК (эпсилон-аминогруппой лизина, аминогруппой валина) белков, преимущественно с альбумином (60%). Используются для оценки усредненного значения сахара крови и контроля диабета наряду с гликированным гемоглобином. В отличие от гликогемоглобина, позволяющего оценить уровень сахара за 3-4 месяца, анализ фруктозамина даёт информацию об уровне за 1-3 недели, благодаря более короткому периоду полужизни гликозилированных белков крови по сравнению с гемоглобином. В сыворотке крови практически здоровых лиц концентрация фруктозамина составляет 2-2,8 ммоль/л, у больных диабетом при удовлетворительной компенсации углеводного обмена – 2,8-3,2 ммоль/л, а при декомпенсации диабета – выше 3,7 ммоль/л. КДЗ: уточнение диагноза, оценка степени компенсации СД, выбор адекватной терапии.

Обнаружена прямая зависимость между содержанием в крови HbA1c и степенью диабетической ангиопатии. В старых эритроцитах содержится больше HbA1c, чем в молодых. Альбумин сыворотки крови в результате неферментативного гликозилирования теряет свои транспортные и детоксикационные свойства, перестает связывать билирубин и длинноцепочечной жирные кислоты. Мембраны эритроцитов при неферментативном гликозилировании их белков теряют свою эластичность, в результате чего эритроцит не может изменить форму, проходя по кровеносному капилляру, диаметр которого меньше диаметра эритроцита. При этом нарушается микроциркуляция и снижается время жизни эритроцитов. Н.г.б. интимы сосудов и стенок капилляров снижает их эластичность, что при сахарном диабете приводит к нарушениям кровообращения и диабетической ангиопатии. Иммуноглобулины при гликозилиривании теряют свои свойства, поэтому, по-видимому, при сахарном диабете снижены защитные реакции организма. Н.г.б. базальных мембран клубочковых капилляров почек вызывает утолщение этих мембран и изменение их проницаемости, чем во многом обусловлена диабетическая ангионефропатия. Коллаген соединительнотканных волокон гликозилируется по остаткам лизина и оксилизина, что мешает образованию нормальных поперечных сшивок между волокнами и приводит к снижению эластичности коллагенового волокна, особенно проявляющемуся при сахарном диабете и старении организма. Н.г.б. оболочек нервных волокон, в т.ч. миелина, вызывает изменение их функции и нарушение проведения нервного импульса, в результате чего развивается диабетическая невропатия. Установлено достоверное увеличение степени неферментативного гликозилирования при сахарном диабете кератинов волос и ногтей. При сахарном диабете, галактоземии, старении часто развивается катаракта, обусловленная неферментативным гликозилированием основного белка хрусталика глаза кристаллина. Гликозилированный инсулин теряет способность связываться со специфическими циторецепторами. Большинство неферментативно гликозилированных белков труднее подвергается протеолизу.

Для изучения Н.г.б. большое значение имеет выбор адекватного метода исследования. Простыми, сравнительно дешевыми, достаточно чувствительными и высоко специфичными являются хроматография, электрофорез, иммунологические и химические методы. Наиболее применимыми оказались химические методы определения гликозилированных белков, к которым относятся метод, основанный на повышенной редуцирующей способности кетоаминных соединений, образующихся в процессе Н.г.б., и метод, заключающийся в количественном определении фруктозы, отщепившейся от неферментативно гликозилированного белка после гидролиза кетоаминной связи. Надежные результаты получены при использовании мягкого гидролиза кетоаминной связи в гликозилированных белках органическими кислотами (щавелевой и трихлоруксусной).