Обнаружение возбудителя бруцеллеза с помощью кольцевой реакции и РА.

Сущность кольцевой реакции.

По наблюдениям некоторых ученых данная реакция пригодна для исследования фляжного молока, если оно содержит молоко хотя бы одной бруцеллезной коровы.

Молоко повышенной кислотности (32-33ºТ), молозиво, молоко коров, больных маститом, и содержимое молочной железы сухостойных коров не дают правильных показателей по этой реакции. Пробы молока, консервированные формалином, разведенные пополам водой, и свежие сливки после их разведения 10% раствором хлорида натрия 1:1 можно исследовать по кольцевой реакции.

Реакция заключается в том, что добавленный в молоко бруцеллезный антиген соединяется (склеивается) с антителом. Возникший комплекс антитело+антиген адсорбируется на жировых шариках, которые при температуре реакции поднимаются на поверхность содержимого пробирки, образуя кольцо синего цвета. При отсутствии антител антиген распределяется равномерно в молоке и синее кольцо не образуется.

Техника определения.

В агглютинационные пробирки наливают 1мл исследуемого молока и добавляют 1каплю цветного бруцеллезного антигена (смыв культуры бруцелл, окрашенных гематоксилином). Для равномерного распределения антигена в молоке содержимое встряхивают и пробирки ставят в термостат при 37-39ºС на час, после чего читают реакцию.

При исследовании молока овец кольцевой реакцией рекомендуется разводить молоко 10-20% раствором хлорида натрия или молоком коровы (здоровой) 1:1.

«+» реакция – характеризуется тем, что в верхнем слое пробирки появляется кольцо, окрашенное в интенсивно синий цвет при некотором просветлении содержимого пробирки;

«-» реакция – равномерное окрашивание содержимого; слой сливок остается белого или коричневого цвета.

«±» реакция – наличие слабого окрашивания кольца без просветления содержимого пробирки.

Реакция агглютинации.

Техника определения.

К 10мл теплого молока (35-37ºС) + 5капель 10% сычужного фермента (на физ.растворе) и помещают на 5мин в водяную баню при температуре 38-40ºС для быстрого свертывания. Свернувшееся молоко обводят стеклянной палочкой по стенке пробирки, центрифугируют и полученную прозрачную надосадочную жидкость (сыворотку) используют для исследования. Для реакции берут по 1мл сыворотки в 6 разведениях (1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80 и 1:160), добавляют в каждую пробирку по 0.5 мл стандартного антигена, затем пробирки встряхивают и помещают на 30мин в термостат при 37ºС. После выдержки в термостате пробы центрифугируют 5мин при 3000об/мин и читают реакцию.

«+» реакция – в пробирке появляется осадок в виде круглой шляпки, которая при взбалтывании разбивается на хлопья и комочки.

«-» реакция – осадок при взбалтывании образует равномерную муть.

Для осаждения казеина вместо сычужного фермента можно применять уксусную кислоту.

Способы установления молока коров, больных маститом.

Методические указания.

Для диагностики субклинических маститов используют основные пробы с димастином или мастопримом. Если эти реакции положительные, их уточняют пробой «отстаивания». При заболевании у коров вымени в молоке увеличивается число лейкоцитов и проявляется щелочная реакция (рН 7 и выше), что устанавливают с помощью димастина и мастоприма, содержащих поверхностноактивные вещества, которые, взаимодействуя с лейкоцитами, образуют сгусток, а индикатор изменяет цвет в зависимости от реакции среды (рН).

А. Бромтимоловая проба.

Техника определения.

На белую фарфоровую пластинку наносят 2-4капли исследуемого молока и 1-2капли 0.2% спиртового (спирт 60%) раствора бромтимолового синего.

Желтое, зеленовато-желтое или желто-зеленое окрашивание характерно для молока, полученного от здоровой коровы. Молоко коров, больных маститом, в зависимости от стадии заболевания и его характера окрашивается в цвета от сине-зеленого до желтоватого.

Б. Лейкоцитарная проба.

Техника определения.

На молочно-контрольную пластинку наносят 5капель молока и 1каплю 4% едкого натра, перемешивают палочкой в течение 20с и определяют результат пробы. При воспалительном процессе в молочной железе (мастит) на пластинке появляется желеобразная масса (значительное количество лейкоцитов), а при нормальном количестве лейкоцитов изменения не наблюдаются – проба отрицательная.

Реакция заключается в том, что под влиянием щелочи лейкоциты растворяются с освобождением ДНК (вещество ядра), обуславливающей желеобразование в пробе.

В. Проба отстаиванием.

Техника определения.

В пробирку наливают по 10-15мл исследуемого молока и отстаивают его при температуре 4-8ºС. Пробирки просматривают вначале через 2-3ч и окончательно через 16-24ч.

В молоке с наличием мастита на дне пробирки появляется осадок белков молока, клеток и микробов, в котором при микроскопировании обнаруживается значительное количество лейкоцитов. Такое молоко часто бывает водянистым, с синеватым оттенком (субклиническая форма). Появление розового цвета в слое сливок будет свидетельствовать о наличии эритроцитов.

Г. Проба с димастином.

Техника определения

В луночки молочно-контрольной пластинки помещают по 1мл исследуемого молока, затем вносят по 1мл димастина. Перемешивают реактив и молоко вращательными движениями и в каждой луночке определяют консистенцию и цвет смеси.