Иммунофенотипирование лимфоцитов с помощью проточной цитофлюоримерии

Универсальным методом исследования лейкоцитов является метод лазерной проточной цитофлюориметрии, который позволяет не только получить детальные характеристики клеточных субпопуляций, но производить их препаративное разделение. Прежде всего, на основе анализа светорассеивания (без применения антител) в исследуемом образце можно определить содержание лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов. Используя метод иммунофлюоресценции (прямой или непрямой), можно определить численность различных субпопуляций лимфоцитов. Помимо регистрации свечения, возможна оценка его интенсивности. Обработка полученных данных по специальной программе позволяет определить количество сайтов связывания, т. е. вычислить плотность данного рецептора на клеточной мембране. За ограниченный отрезок времени можно произвести большое число анализов.

Для определения специфических клеточных рецепторов, маркеров и антигенов применяют моноклональные антитела (МАТ) специфичные к определенным эпитопам данных структур. Для проведения исследования осуществляют следующие основные этапы:

1) выделение клеток — из крови пациента выделяют фракцию мононуклеаров, тщательно отмывают их от белков жидкой части крови и подсчитывают количество в 1 мл.

2) постановка реакции с моноклональными антителами (МАТ) определенной специфичности — полученную взвесь клеток инкубируют с моноклональными антителами, специфичными к определенному CD-маркеру и мечеными флюорохромом.

3) регистрация результатов с применением проточного цитофлюориметра (цитометра), позволяющего определять процент и абсолютное содержание клеток, прореагировавших с данными МАТ, путем подсчета общего количества клеток и клеток, несущих флюоресцентные метки (связавшиеся с меченными МАТ).

Моноклональные антитела (МАТ) ¾ это особый вид иммунных сывороток, отличающихся высокой специфичностью. Они представляют собой биохимически гомогенные молекулы антител, обладающие паратопом (гипервариабельным участком Fab фрагмента антитела) единственной, строго определенной специфичности. МАТ против одного определенного антигенного эпитопа идентичны по физико-химическим свойствам, специфичности, аффинности и относятся к одному классу и типу иммуноглобулинов. Моноклональные антитела точнее, чем обычные иммунные сыворотки, выявляют мельчайшие антигенные структуры. Их широко применяют в современных иммуноферментных, иммунофлюоресцентных и радиоиммунных методах выявления антигенов и антител.

В условиях макроорганизма получить моноклональные антитела практически невозможно. Сложность в том, что на одну и ту же антигенную детерминанту (эпитоп) одновременно реагируют множество различных клонов В-лимфоцитов, что обусловливает большое разнообразие продуцируемых антител. Получают МАТ с помощью гибридомной технологии. Гибридомы представляют собой гибридные клетки, образованные при воздействии полиэтиленгликоля из короткоживущих В-лимфоцитов, вырабатывающих специфические антитела, и миеломных (опухолевых) клеток, не продуцирующих антител, но непрерывно размножающиеся в культуре клеток. Полученные после слияния клетки культивируют в специальной питательной среде, поддерживающей рост только гибридом, и проводят разведение суспензии клеток до одной гибридомы на лунку. Затем поддерживают жизнеспособность необходимых клонов гибридом, которые продуцируют определенные МАТ.

Этапы получения гибридомных клеток:

• Иммунизация мышей нужным антигеном.

• Получение культуры В-лимфоцитов из селезенки иммунизированной мыши.

• Слияние иммунных B-лимфоцитов с опухолевыми клетками В-миеломы, способными делиться бесконечно.

• Отбор жизнеспособных гибридов на селективной питательной среде. Популяция отобранных гибридов способна синтезировать антитела нужной специфичности в неограниченном количестве.

• Гибридомы размножают в искусственных питательных средах или в организме животных в виде асцитных опухолей. При росте опухоли в организме мыши в асцитическую жидкость поступает большое количество антител.

Для оценки функциональной активности лимфоцитов предложена реакция трансформации лимфоцитов в бласты (РБТЛ). Бласты ¾ это крупные клетки, в которых происходит интенсивный синтез ДНК. При культивироании in vitro Т-лимфоциты превращаются в бласты под влиянием фитогемагглютинина (ФГА) ¾ это митоген из бобовых растений. В-лимфоциты превращаются в бласты под влиянием липополисахарида (ЛПС) бактерий. При добавлении микробных или иных АГ в культуру лимфоцитов in vitro, они отвечают формированием клонов бластов с соответствующим видом рецепторов, что может ипользоваться для оценки индивидуальной чувствительности организма человека к данному АГ или аллергену при диагностике аллергии.

Способность образовывать бласты в ответ на стимуляцию ФГА отражает степень готовности иммунной системы к иммунному ответу. Количество образующихся бластных клеток оценивают через 24 часа инкубации лимфоцитов с митогеном путем микроскопии либо радиоизотопным методом. В норме у взрослого человека после стимуляции ФГА не менее 70% лимфоцитов должно превращаться в бласты. Снижение этого показателя свидетельствует об угнетении иммунной системы.

Иммунный статус каждого человека индивидуален, поэтому для выявления изменений в иммунограмме нужно иметь ее показатели, определенные у данного человека на фоне полного здоровья. Для установления факта иммунодефицита имеют значительные (20-30%) стабильные в течение продолжительного времени сдвиги в иммунограмме. Заключение о наличии нарушений в иммунном статусе дается врачом аллергологом-иммунологом на основании комплекса клинических и лабораторных данных (табл. 33).

Таблица 33. Показатели иммунограммы и их значение у здоровых лиц

Основные правила интерпретации иммунограмм:

1. Комплексный анализ иммунограммы более информативен, чем оценка каждого показателя в отдельности.

2. Анализ иммунограммы в динамике всегда более информативен как в диагностическом, так и в прогностическом отношении, нежели однократно полученная иммунограмма.

3. Реальную информацию несут лишь сильные сдвиги показателей (не менее 20% от нормы).

4. Полноценный анализ иммунограммы можно проводить лишь в комплексе с оценкой клинической картины заболевания у данного пациента.

5. Учет возможных индивидуальных особенностей (возраст, сопутствующие заболевания) и колебаний показателей (физиологических и патологических ¾ прием пищи, физические нагрузки, время суток, действие стрессоров и т.д.), учет региональных норм.

6. Отсутствие существенных сдвигов показателей иммунограммы при наличии выраженной картины воспалительного процесса свидетельствует об атипичной реакции иммунной системы и является отягощающим признаком течения процесса.

7. В подавляющем большинстве случаев анализ иммунограммы позволяет делать ориентировочные, а не безусловные выводы.