Биологический метод диагностики инфекционных заболеваний

Биологический метод заключается в выделении чистой культуры возбудителя путем заражения лабораторных животных исследуемым материалом от больного и последующим бактериологическим исследованием трупа животного.

Биологический метод проводится с использованием чувствительных лабораторных животных. Для экспериментального заражения чаще использу­ют белых мышей, крыс, морских свинок и кроликов. Для некоторых специальных исследований служат обезьяны, кошки, собаки, лошади, крупный и мелкий рогатый скот, дикие животные (хомяки, суслики, дикие крысы, полев­ки), птицы (куры, голуби и т. д.), а также куриные эм­брионы. При выборе вида лабораторного животного необходимо учитывать степень его восприимчивости к изучаемому возбудителю инфекции. Для получения сравнимых ре­зультатов исследования проводят на животных одного вида, пола и массы.

Лабораторные животные используются не только с целью выделения и накопления чистой культуры, но и для изучения клинической картины заболевания и для учета реакции нейтрализации токсина антитоксической сывороткой.

Существуют следующие способы заражения: подкож­ный, внутрикожный, накожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, пероральный (через рот), интраназальный (через нос в дыхательный тракт), вве­дение в глаз, введение в центральную нервную систему. При внутрикожном или накожном способе зара­жения шерсть на месте введения или нанесения материа­ла удаляют выстриганием, выщипыванием или депилированием.

Вскрытие следует производить непосред­ственно после гибели животного, чтобы избежать про­никновения микроорганизмов из кишечника в кровь и другие органы. Все наблюдения, сделанные во время вскрытия, про­токолируют. Отмечают вид животного, номер, время и место заражения, материал, применяемый для зараже­ния, время гибели, обнаруженные изменения и т. д. Во время вскрытия необходимо следить за тем, чтобы жид­кость и кусочки тканей и органов не попали на стол. После каждой манипуляции инструменты промывают водой или спиртом и прожигают. Отмечают цвет, величину и консис­тенцию каждого органа. Из измененных органов (или из всех, в зависимости от цели эксперимента) делают высев на питательные среды, мазки и мазки-отпечатки. Для посева прижженную поверхность органа надрезают сте­рильным скальпелем, из глубины органа вырезают ма­ленький кусочек, часть его помещают в питательную среду, а из другой делают мазки-отпечатки, приклады­вая срезанную часть к стеклу. Обязательно делают по­сев крови из сердца. Для этого прижигают раскаленным скальпелем верхушку сердца и стерильной пастеровской пипеткой прокалывают прожженный участок, кровь при этом поднимается в капилляр. Кровь из капилля­ра выдувают в жидкие питательные среды и делают из нее мазки. После окончания вскрытия производят тщательную уборку рабочего места. Труп животного сжигают или автоклавируют. Инструменты стерилизуют кипячением или автоклавируют. Доску или кювету протирают спиртом и прожигают или заливают на сутки дезинфицирую­щим раствором. Мазки фиксируют в пламени или жид­ким фиксатором, окрашивают и изучают.

Биопроба — метод контроля биологических препаратов (вакцин, сывороток), основанный на их введении лабораторным животным с целью оценки токсичности, пирогенности и иммунологической активности.

III. План практической работы

1. Провести обнаружение бактериальных структур, являющихся факторами патогенности

а) капсулы бактерий в готовых мазках

Для обнаружения капсул используют метод Бурри-Гинса: на первом этапе тушь, обтекая капсульные бактерии, создает черный или коричневый фон (соответствующий цвету туши) на котором хорошо видны неокрашенные бактерии, которые на втором этапе окрашиваются фуксином в красный цвет, а капсула остается бесцветной. Таким образом, капсулы бактерий хорошо видны на темном фоне в виде прозрачных, белых ореолов вокруг красных бактерий.

б) жгутиков бактерий — зарисовать различные варианты расположения жгутиков (монотрих, лофотрих, амфитрих, перитрих).

По количеству и расположению жгутиков различают монотрихи — один жгутик, перитрихи — жгутики по всей поверхности бактериальной клетки, лофотрихи — пучок жгутиков на одном конце клетки, амфитрихи — единичные жгутики или пучки жгутиков на разных полюсах клетки.

в) корд-фактора у патогенных микобактерий

При культивировании микобактерий на предметных стеклах, погруженных в жидкую среду на основе цитратной крови, микроколонии вирулентных штаммов вырастают в виде переплетающихся кос — тяжей, вследствие наличия корд-фактора. Для их обнаружения стекла окрашивают по методу Циля-Нильсена и проводят иммерсионную микроскопию (метод микрокультивирования по Прайсу).

2. Учесть результаты определения факторов патогенности стафилококка: гемолизина, лецитиназы и плазмокоагулазы.

Гемолизин (экзофермент, по механизму действия мембранотоксин) определяют путем посева испытуемой культуры на чашки Петри с кровяным агаром. Посевы инкубирую при 37°С в течение 18-24 часов. Вокруг колоний гемолитических микроорганизмов образуются зоны полного (β) или неполного, зеленящего (α) гемолиза.

Для обнаружения лецитиназы производят посев исследуемой культуры на питательный агар с лецитином (желточный агар). Вокруг колоний бактерий, выделяющих фермент, образуется зона помутнения с перламутровым блеском.

Плазмокоагулаза выявляется при посеве испытуемой культуры в 0,4 мл стерильной цитратной плазмы крови. Посевы инкубируют при 37°С в течение 2-5 ч. В случае образования фермента происходит свертывание плазмы (образование геля), а в контроле она остается жидкой (золь).

3. Учесть результаты определения токсигенности дифтерийной палочки, зарисовать.

Полоску фильтровальной бумаги, пропитанной антитоксической противодифтерийной сывороткой, накладывают на поверхность прозрачного сывороточного агара в чашке Петри. Культуры дифтерийной палочки сеют бляшками на расстоянии 0,6-0,8 см от полоски фильтровальной бумаги и 1-1,5 см друг от друга. Исследуемые и контрольную (токсигенную) культуры дифтерийной палочки чередуют с одной стороны полоски фильтровальной бумаги, а напротив, с другой стороны полоски сеют одноименные культуры (дубли). Чашку инкубируют при 37^◦С в течение 24-48 часов. Затем проводят учет. Положительной реакция считается при наличии тонкой линии преципитата между полоской фильтровальной бумаги и ростом бактерий в виде бляшки, отрицательной — при её отсутствии. Реакция считается специфичной, если контрольная (токсигенная) культура дала положительный результат.

4. Зарисовать схему этапов проведения биологического метода диагностики инфекционных заболеваний.

5. Заполнить таблицы по теме занятия

6. Решить ситуационные задачи

УИРС. Учесть результаты чувствительности микрофлоры зева к антибактериальным препаратам, заполнить таблицу.

IV. Примеры ситуационных задач

Ситуационная задача № 1

Больной А, 18 лет, поступил в инфекционное отделение с карбункулом затылочной области. При проведении бактериологического исследования выделена чистая культура этиологического агента инфекционного заболевания. При изучении факторов патогенности выделенной чистой культуры выявлена зона опалесценции на желточном агаре и зона полного просветления на кровяном МПА. Дайте характеристику данного микроорганизма.

1. лецитиназа положительный
2. лецитиназа отрицательный
3. плазмокоагулаза положительный
4. уреаза положительный
5. гемолитический (β-гемолиз)

В инфекционное отделение детской областной больницы поступил ребенок 6 лет с подозрением на дифтерию. В ходе бактериологического исследования выделена чистая культура дифтерийной палочки (Corynebacterium diphtheriae). При проведении реакции преципитации в агаровом геле с антитоксической противодифтерийной сывороткой определяется зона преципитации. Сформулируйте заключение:

1. исследуемая культура дифтерийной палочки лецитиназа положительна
2. исследуемая культура дифтерийной палочки токсигенна
3. исследуемая культура дифтерийной палочки коагулаза положительна
4. исследуемая культура дифтерийной палочки не токсигенна

Теоретические вопросы для рубежного контроля знаний

1. Антибиотики и антимикробная терапия

2. Основные группы химиопрепаратов и антибиотиков

3. Механизмы действия антибактериальных препаратов на микроорганизмы

4. Побочное действие антибиотиков

5. Механизмы антибиотикорезистентности микроорганизмов

6. Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам

7. Учение об инфекции. Понятия «инфекция» и «инфекционное заболевание»

8. Формы симбиоза

9. Классификации инфекционных заболеваний и форм инфекций

10. Периоды и исходы инфекционного заболевания

11. Патогенность и вирулентность, единицы вирулентности

12. Основные факторы патогенности микроорганизмов

13. Микробные токсины

14. Биологический метод диагностики инфекционных заболеваний