Механизм, ингредиенты иммуноблоттинга

Иммуноблоттинг (ИБ) — высокочувстви­тельный метод, основанный на сочетании электрофореза и ИФА. Смесь антигенов микроорганизма (родовых, видовых, групповых) разделяют на фракции, содержащие отдельные антигены с помощью электрофоре­за в полиакриламидном геле. Затем переносят его (блоттинг ¾ от англ. blot, пятно) из геля на нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Фирмы выпускают такие полоски с «блоттами» антигенов. На эти полоски наносят сыворотку больного. Затем после инкубации отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов челове­ка, меченую ферментом. Образовавшийся на полоске комплексы антиген + антитело больно­го + антитело против Ig человека, меченое ферментом, выявляют до­бавлением субстрата и хромогена, изменяющих окраску под действием фермента. ИБ используют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции, сифилисе, листериозе и других инфекциях.

6. Механизм, ингредиенты иммунной электронноймикроскопии (ИЭМ)

Иммунная электронная микроскопия ¾ электронная микроскопия микробов, чаще вирусов, обработанных соответствующими антителами. Вирусы, обработанные иммунной сывороткой, образуют иммунные агрегаты (микропреципитаты). Вокруг вирионов образуется «венчик» из антител, контрастированный фосфорно-вольфрамовой кислотой или другими электронно-оптически плотными препаратами. То есть этот метод представляет собой непосредственную визуализацию взаимодействия антигена и антител методом электронной микроскопии.

Методически тест ИЭМ выполняется в следующей последовательности:

1. Материал, в котором предполагается наличие искомого вируса, смешивается и инкубируется со стандартной иммунной сывороткой.

2. Комплекс вирус-антитело осаждается центрифугированием в подходящих для него режимах.

3. К ресуспендированному осадку добавляется контрастирующее вещество, и полученный препарат исследуется под электронным микроскопом. В качестве данного вещества используется ферритин ¾ белок, содержащий до 23 % железа, хорошо контрастирующий и поэтому применяющийся в качестве метки. После обработки мечеными АТ изучаемых объектов (вирусов, бактерий, срезов инфицированных клеток) они становятся электронноплотными и могут быть выявлены при электронной микроскопии.

В случае положительной реакции выявляются характерные агрегаты, состоящие из вирусных частиц, соединенных между собой мостиками из антител. Порог чувствительности ИЭМ невысок: надежное выявление вируса осуществимо, когда его концентрация в исходном материале составляет 10⁴-10⁶ частиц в мл. Преимуществом метода является возможность оценивать не только исход серологической реакции, но и идентифицировать ее морфологический субстрат, т. е. определить форму и размер вирусных частиц. При наличии препаратов вируса с известным содержанием частиц ИЭМ может применяться и для количественного определения антител в сыворотках, для чего предложена специальная система учета интенсивности взаимодействия вируса и антител.

Современные тест-системы для серологической диагностики дают возможность определять не только суммарные антитела (антитела одной специфичности, принадлежащие к разным классам иммуноглобулинов), но и отдельно специфические IgG, IgM, IgA.

Таблица 30. Интерпретация результатов, основанных на определении комбинации IgG, IgM, IgA

Наличие класса антител	Интерпретация
IgG	IgM	IgA
- (+)	+	- (+)	Острая стадия заболевания
+	-	-	Перенесенная или текущая инфекция
- (+)	-	+	Текущая или хроническая инфекция

Рис. 28. Типичная динамика гуморального ответа на первичное и повторное инфицирование

III. План практической работы

1. Разобрать схему постановки и учёсть результаты ИФА с целью выявления антител в сыворотке крови больного при диагностике ВИЧ.

Для постановки ИФА используются наборы (тест-системы), содержащие все необходимые ингредиенты для реакции. Из дополнительного оборудования необходимы: дозаторы с одноразовыми наконечниками, термостат, шейкер (встряхиватель), вошер (промыватель), ридер (спектрофотометр) для микропланшет. Этапы реакции:

1. В лунки микропланшета, сорбированные специфическими антигенами, вносят исследуемые сыворотки, положительные и отрицательные контроли. Инкубация. Промывка.

2. В лунки вносят конъюгат (антиглобулиновую сыворотку с антителами, мечеными ферментом). Инкубация. Промывка.

3. В лунки вносят субстратно-хромогенную смесь. Инкубация.

4. В лунки вносят стоп-раствор, останавливающий цветную биохимическую реакцию.

5. Учет результатов: измеряют оптические плотности контрольных и опытных лунок. По формуле рассчитывают критическое значение оптической плотности (ОП крит.). Сыворотки, давшие ОП равные или выше ОП крит., считаются положительными и в отношении их делается заключение о наличии специфических антител.

ОП крит. = ср. знач. ОП К- + 0,200

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

 

 

где ОП крит. ¾ критическое значение оптической

плотности; ср. знач. ОП К^- ¾ среднее значение

оптической плотности отрицательных контролей;

0,200 ¾ коэффициент, устанавливаемый методом

статистической обработки результатов на

предприятии-изготовителе тест-системы.

 

2. Изучить механизм, зарисовать схему иммуноблоттинга в диагностике ВИЧ.

3. Изучить механизмы прямой и непрямой РИФ для выявления антител к антигенам Chlamidia trachomatis.

Прямая РИФ Непрямая РИФ

1. Материал, содержащий микроорганизмы, 1. Материал, содержащий микроорганизмы,

фиксируется на стекле и обрабатывается фиксируется на стекле и обрабатывается

специфической люминесцентной сывороткой. специфической сывороткой.

2. Инкубация. Промывка. 2. Инкубация. Промывка.

3. Микроскопия мазка с использованием 3. Мазок обрабатывается антиглобулиновой

люминесцентного микроскопа. люминесцентной сывороткой.

4. Инкубация. Промывка.

5. Микроскопия мазка с использованием

люминесцентного микроскопа.

IV. Примеры ситуационных задач

Задача 1. При учёте ИФА с целью обнаружения антител к антигенам ВИЧ получены следующие значения оптической плотности в контрольных лунках, где А1, В1 ¾ положительные контроли, С1, D1, E1, F1 ¾ отрицательные контроли, G1, H1 ¾ контроль конъюгата; А1 ¾ 2,7; В1 ¾ 2,9; С1 ¾ 0,13; D1 ¾ 0,15; E1 ¾ 0,11; F1 ¾ 0,14; G1 ¾ 0,18; H1 ¾ 0,16; оптическая плотность рабочей лунки А2 ¾ 0,378. Оцените результат ИФА с целью обнаружения антител к антигенам ВИЧ в исследуемой сыворотке, внесенной в лунку А2.

А. Контроли тест-системы специфичны

Б. Контроли тест-системы неспецифичны

В. Результат положительный

Г. Результат отрицательный

Задача 2. При учёте ИФА с целью обнаружения антител к антегенам ВИЧ получены следующие значения оптической плотности в контрольных лунках, где А1, В1 ¾¾ положительные контроли, С1, D1, E1, F1 ¾ отрицательные контроли, G1, H1 ¾ контроль конъюгата;: А1 ¾ 2,7; В1 ¾ 2,9; С1 ¾ 0,13; D1 ¾ 0,15; E1 ¾ 0,11; F1 ¾ 0,14; G1 ¾ 0,18; H1 ¾ 0,16; оптическая плотность рабочей лунки А5 ¾ 0,273. Оцените результат ИФА с целью обнаружения антител к антегенам ВИЧ в исследуемой сыворотке, внесенной в лунку А5.

А. Контроли тест-системы специфичны

Б. Контроли тест-системы неспецифичны

В. Результат положительный

Г. Результат отрицательный

Задача 3. При учёте ИФА с целью обнаружения антител к антегенам ВИЧ получены следующие значения оптической плотности в контрольных лунках, где А1, В1 ¾ положительные контроли, С1, D1, E1, F1 ¾ отрицательные контроли, G1, H1 ¾ контроль конъюгата; А1 ¾ 2,7; В1 ¾ 2,9; С1 ¾ 0,23; D1 ¾ 0,25; E1 ¾ 0,21; F1 ¾ 0,24; G1 ¾ 0,18; H1 ¾ 0,26; оптическая плотность рабочей лунки А2 ¾ 0,378. Оцените результат ИФА с целью обнаружения антител к антегенам ВИЧ в исследуемой сыворотке, внесенной в лунку А2.

А. Контроли тест-системы специфичны

Б. Контроли тест-системы неспецифичны

В. Результат положительный

Г. Результат отрицательный

Тема 4: Оценка иммунного статуса человека. Иммунопрофилактика и иммунотерапия: вакцины, сыворотки, иммуноглобулины, бактериофаги. Иммунодиагностика: диагностикумы, аллергены, бактериофаги. Медицинская биотехнология

Цель: знать тесты оценки иммунного статуса человека: клеточных и гуморальных факторов врожденного и приобретенного иммунитета; методы их определения; механизм, технику постановки и учёт реакции Манчини; механизм, технику постановки и учёт теста определения титра комплемента; получение биологических препаратов (вакцин, сывороток, иммуноглобулинов, аллергенов, диагностикумов, бактериофагов); сроки плановой вакцинации и ревакцинации; биотехнологические методы получения биопрепаратов; уметь учитывать реакцию Манчини; учитывать тест определения титра комплемента; разбираться в маркировке биопрепаратов.

Задание на дом:

I. Вопросы для самоподготовки:

1. Иммунный статус человека. Понятие, уровни, тесты оценки.

2. Тесты оценки иммунного статуса человека I уровня и методы их определения.

3. Тесты оценки иммунного статуса человека II уровня и методы их определения.

4. Реакция Манчини: цель, механизм и ингредиенты реакции Манчини.

5. Механизм, ингредиенты, постановка реакции определения титра комплемента.

6. Понятие об иммунопрофилактике и иммунотерапии. Показания к вакцинации и противопоказания.

7. Виды и методы получения вакцин.

8. Метод получения, цель применения анатоксинов.

9. Природа, цели применения адьювантов.

10. Виды, методы получения, цели применения иммунных сывороток.

11. Цели применения бактериофагов.

12. Иммунологические препараты для диагностики инфекционных заболеваний.

13. Виды, методы получения и цели применения диагностикумов.

14. Аллергены, методы получения и цель использования.

II. Базовый текст