Учесть и зарисовать ИФА в диагностике ВИЧ-инфекции (см. схему твердофазной ИФА в базовом тексте)

Ингредиенты реакции: исследуемая сыворотка для выявления антител к поверхностным антигенам (гликопротеинам) ВИЧ,лунки планшеток с сорбированным ВИЧ антигеном , антиглобулиновая сыворотка, меченная ферментом (пероксидазой хрена) и субстрат/хромоген для фермента (перекись водорода + ортофенилендиамин — ОФД)

Постановка ИФА: В лунки планшетокс сорбированным ВИЧ антигеном добавляют исследуемую сыворотку больного. Выдерживают 60 мин. при комнатной температуре и промывают каждую лунку буферным раствором для удаления несвязанных компонентов. В каждую лунку вносят антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом (пероксидазой хрена). Выдерживают 60 мин при комнатной температуре и промывают каждую лунку буферным раствором для удаления несвязанных компонентов. Затем добавляют субстрат/хромоген для фермента (перекись водорода + ортофенилендиамин — ОФД).

Учёт ИФА. При образовании комплекса + + , субстрат (перекись водорода) расщепляется ферментом (пероксидазой хрена) на конечные продукты кислород и воду. В присутствии кислорода индикатор (ОФД) изменяет цвет продукта реакции — с бесцветного на желто-коричневый. Интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. Определяют оптическую плотность содержимого каждой лунки (контрольных и рабочих) с помощью фотоколориметра.

1. Определение специфичности контролей: контроли специфичны, если

ОП «+» контролей >1, а ОП «-»<0,2.

2. Расчет ОП критической

ОП крит. = ср. знач. ОП К^- + 0,200

где ОП крит.- критическое значение оптической плотности; ср. знач. ОП К^--- среднее значение оптической плотности отрицательных контролей; 0,200 — коэффициент, устанавливаемый методом статистической обработки результатов на предприятии-изготовителе тест-системы.

3. Определение результата реакции:

результат положительный, если ОП рабочей лунки > ОП крит.,

результат отрицательный, если ОП рабочей лунки < ОП крит.

Заключение: Например, контроли специфичны и результат положительный, следовательно, в исследуемой сыворотке содержатся антитела к ВИЧ.

 

Зарисовать схему молекулярной гибридизации (МГ)

Метод молекулярной гибридизации ДНК-ДНК используется для установления геномного родства в пределах рода и семейств микроорганизмов; РНК-ДНК на уровне порядка. Степень сходства или гомологичность последовательностей ДНК выражается процентом (%) гомологии и является мерой геномного родства микроорганизмов.

Схема точечной гибридизации

1. ДНК наиболее типичного штамма метится изотопом ³H тритием или ³²P фосфором
2. Фрагментация и денатурация меченой ДНК
3. Исследуемая ДНК денатурируется, но не фрагментируется и иммобилизуется на твердой фазе, например на гранулированном агаре, мембранных фильтрах (нитроцеллюлозные или нейлоновые)
4. Инкубация исследуемой ДНК с меченой ДНК в жидкой среде. При гомологии фрагменты меченой гибридизируются с исследуемой, т.е. формируется двунитчатая структура
5. Для повышения точности метода применяют обработку гибридов специфическим ферментом — нуклеазой S₁, которая способна «отсеивать» от гибридных дублексов непрореагировавшие одноцепочечные участки
6. Отделение гибридов с помощью гидроксиаппатита, т.е. отмывка гибридов от балластного материала
7. Подсчет радиактивности на счетчиках с определением % гомологии ДНК

Недостаток метода — короткий период полураспада фосфора и наличие специфического оборудования.

Блот-гибридизация

Метод выявления фрагментов ДНК, разделенных электрофорезом в агарозе. ДНК предварительно нарезается с помощью рестрикционных эндонуклеаз из суммарной ДНК. Перенос фрагментов ДНК на нитроцеллюлозные фильтры и обработка мечеными зондами.

Гибридизация in situ

Позволяет выявить нуклеиновые кислоты в инфицированных клетках. Клетки, после денатурации нуклеиновой кислоты, обрабатываются немечеными зондами, формирующими гибридные двунитчатые структуры, затем обработка меченой флюорохромом сывороткой к гибридомам. При наличии в материале незначительных количеств нуклеиновой кислоты вирусов применяется ПЦР.