Проточная цитометрия. Принципы, использование в иммунологической и гематологической практике.

Проточная цитометрия (ПЦ) представляет собой технику для быстрого оптического анализа отдельно взятых клеток. Методика заключается в выявлении рассеяния света лазерного луча при прохождении через него клетки в струе жидкости, причём, степень световой дисперсии позволяет получить представление о размерах и структуре клетки. Кроме того, в ходе анализа учитывается уровень флуоресценции химических соединений, входящих в состав клеточной стенки (аутофлуоресценция) или внесённых в образец перед проведением проточной цитометрии.

Это метод, в основу которого положено измерение характеристик клеток, их состовляющих, а также последующего физического отделения интересующей субпопупяции клеток или микрочастиц на основании анализа измеренных характеристик.

Уникальной особенностью многих клеток и частиц является их способность флуоресцировать. Проточная цитометрия основана на принципах возбуждения светом и эмиссии флуорохромных молекул. При помощи этого метода можно получать информацию о частицах и клетках размером от 0.5 до 4.0 мкм. Через проточные цитометры проходят гидродинамически сконцентрированные клетки, на которые воздействует источник света. В качестве источника света наиболее часто используют лазеры.

Как только на клетки или частицы попадает луч света, флуорохромы переходят на более высокий энергетический уровень. А возврат в исходное состояние происходит при помощи отдачи энергии в виде кванта света. Квант каждого флуорохрома имеет соответствующую длину волны. Испускаемый клетками и частицами свет регистрируется оптическими детекторами. Самым используемым в проточной цитометрии детектором является PMT (photomultiplier tube). Электрические импульсы, порождаемые световыми детекторами PMT-сенсоров, затем обрабатываются линейными и лаг-усилителями. Логарифмическое усиление наиболее часто используется для измерения флуоресцентной способности клеток. Этот тип усиления позволяет усилить слабые сигналы. После усиления сигналов и пульсов производится их обработка с помощью ADC (Analog to Digital Converter), который выводит конечный результат в виде гистограмм.

Методика обладает целым рядом преимуществ перед традиционной цитометрией, в числе которых:

· возможность исследования в ходе одного анализа значительно большего числа клеток (более 100000, тогда как микроскопия позволяет исследовать только несколько сотен клеток), что позволяет получать статистически достоверные результаты и выявлять редкие типы клеток;

· возможность проведения количественных измерений путем дифференцировки интенсивности рассеяния/флуоресценции при различных длинах волн;

· возможность одновременного исследования различных характеристик и структурных компонентов одной клетки.

Типичный аппарат для проведения проточной цитометрии позволяет определять до 5-10 различных параметров клетки, таких как размер, содержание белков, ДНК, липидов, антигенные свойства, активность ферментов и т.п. Кроме того, исследование отдельно взятых клеток даёт возможность выявить и оценить степень гетерогенности популяции, что не всегда может быть достигнуто другими методами.

В настоящее время проточная цитометрия применяется для выявления определённых клеток в исследуемых образцах (как бактериальных и грибковых, так и собственных клеток организма человека), определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам, а также мониторирования состояния вирусного процесса у ВИЧ-инфицированных пациентов.

Выявление бактериальных, грибковых, а также собственных клеток организма в биологических жидкостях крайне важно для диагностики многих заболеваний. В ходе одного из исследований было показано, что проточная цитометрия обладает в 100-1000 раз более высокой чувствительностью по сравнению с микроскопией и позволяет выявлять бактериальные клетки в количестве 10-100 в 1 мл крови. При более низкой концентрации бактерий в образце возможно проведение предварительной инкубации. Высокую чувствительность методу придает использование моноклональных антител, помеченных флуоресцирующим веществом (наиболее часто изотиоцианат).

Проточная цитометрия позволяет не только выявлять инфицирование микроорганизмами, но и определять спектр их чувствительности, причём, длительность исследования не превышает нескольких часов. Подвергнутые воздействию антибиотиков (in vivo или in vitro) микроорганизмы сравнивают с контрольными образцами того же штамма для установления их жизнеспособности, а также изменений в нуклеиновых кислотах, белках, оболочке клеток и т.п., что позволяет оценить как степень эффекта антибиотика, так и точку приложения его действия.

Ещё одной областью применения проточной цитометрии является мониторирование состояния вирусного процесса у ВИЧ-инфицированных лиц путём определения абсолютного количества CD4+ клеток и их доли в популяции лимфоцитов. Методика может также использоваться для контроля эффективности проводимой терапии.

Таким образом, проточная цитометрия обладает рядом преимуществ по сравнению с традиционными методами микробиологических исследований. Появление в последние годы в свободной продаже специальных наборов для выявления целого ряда микроорганизмов позволило значительно расширить диагностические возможности проточной цитометрии. Тем не менее, вопрос стандартизации метода и адекватной интерпретации его результатов остаётся актуальным до сих пор.

71. Исследование пунктата костного мозга: подготовка материала, подсчет миелограммы, интерпретация результатов.

В клинической практике используются два метода исследования КМ: 1) Цитологическое исследование пунктата КМ; 2) гистологическое исследование (трепанобиопсия). Чаще используется цитологическое исследование. Пункцию КМ проводят в процедурном кабинете с соблюдением правил асептики, используют иглу Кассирского с предохранительным щитком-ограничителем и шприц 10-20 мл. Игла и шприц должны быть стерильны и высушены спиртом и эфиром. у взрослых пунктируют чаще грудину (рукоятку или на уровне 3-4 межреберья) по средней линии. Можно пунктировать подвздошную кость, ребра. У детей чаще пунктируют под­вздошную кость, пяточную, нижний эпифиз бедренной кости, грудину. Иглу вводят быстрым движением в костно-мозговой канал, после извлечения мандрена на иглу насаживают шприц и аспи­рируют КМ. Во избежание большой примеси крови к костному мозгу в шприц необходимо набрать материала как можно меньше (несколько капель, 0,1-0,3 мл). После взятия КМ иглу, не разъединяя со шприцем, извлекают из грудины, а место прокола закрывают стерильной наклейкой. Полученный материал переносят на стекло с луночкой или часовое стекло. Пунктат слегка перемешивают стеклянной палочкой. Учитывая быструю коагуляцию пунктата, все дальнейшие манипуляции делают быстро. Из капель пунктата готовят тонкие мазки обычным образом. Производят забор пунктата для подсче­та количества мегакариоцитов и миелокариоцитов в 1 л.

Требования к мазкам КМ, их фиксация и окраска аналогичны таковым к мазкам крови. Готовят как можно больше мазков (не менее 10). Подсчет мегакариоцитов. Подсчет количества мегакариоцитов осуществляют в счетной камере (по всей камере). В 1 мкл пунктата количество клеток равно: количество клеток в камере × 20 (разведение) / 3,2 (объем камеры). Окончательный расчет после сокращения: количество клеток в камере × 6,2. Норма. У взрослых в 1 мкл пунктата КМ содер­жится 30−80 мегакариоцитов. У детей в возрасте от 5 мес до 3,5 го­да − 116 ± 10,8. Увеличение количества мегакариоцитов наблюдается при тромбоцитопенической пурпуре (подавляющая часть клеток не функционирует), ХМЛ, сублейкемическом миелозе, эритремии, после кровопотери, при злокачественных новообразованиях, циррозе печени. Уменьшение количества - при ОЛ, терминаль­ной стадии хронических лейкозов, гипо- и апластических ане­миях, лучевой болезни, мегалобластных анемиях, гиперспленизме.

Подсчет миелокариоцитов (костно-мозговых ядросодержащих клеток) в 1 л пунктата костного мозга (аналогично подсчету числа лейкоцитов в крови). Рассчитывают кол-во миелокариоцитов в 1 мкл пунктата по обычной для подсчета лейкоцитов формуле с учетом большего разведения (количество ядросодержащих клеток в 100 больших квадратах умножают на 500, или полученное число делят на два и прибавляют три нуля). Пример. В 100 больших квадратах подсчитано 120 клеток. Кол-во миелокариоцитов в 1 мкл равно (120:2) × 1000 = 000. Для перевода в единицы СИ полученную цифру умножа­ют на 10⁶. Тогда 60 000 × 10⁶ = 60,0 х 10⁹/л. Норма: 41,6−195,0 × 10⁹/л. Количество миелокариоцитов дает представление о клеточ­ности КМ. Увеличение числа ядросодержащих клеток характерно для ХМЛ, эритремии, ОЛ, гемолитической анемии, мегалобластной анемии, постгеморрагической анемии. Уменьшение количества − для гипо- и апластических анемий, анулоцитоза, лучевой болезни, после цитостатической терапии. Цитологическое исследование костного мозга с подсчетом миелограммы. Фиксируют и окрашивают обычными гематологическими методами 3-5 мазков, остальные приготовленные мазки должны оста­ться в запасе. Очень важно, чтобы мазки КМ были правильно приготовлены и окрашены. Все окрашенные препараты вначале внимательно просматривают под малым увеличением (окуляр 7, объектив 10) для ориентировочного представления о клеточности КМ, наличии и числе мегакариоцитов, обнаружения комплексов опухолевых клеток, скоплений миеломных клеток, клеток Березовского - Штернберга, клеток Гоше и др. В случае выявления патологических элементов на препарат наносят кaплю масла, микроскоп переводят на большое увеличение (окуляр 7, объектив 90) и изучают морфологию этих элементов, оценивают функциональную активность мегакариоцитов. К функционирующим (деятельным) относят те мегакариоциты, рядом с цитоплазмой, которых располагаются отделенные от нее тромбоциты и/или в цитоплазме имеется обильная зернистость, местами собран­ная в скопления, напоминающие тромбоциты. В норме 60−70% мегакариоцитов отделяют тромбоциты.

После просмотра мазков под малым увеличением приступают дифференцировке форменных элементов − подсчету миело­граммы. Миелограмма − процентное содержание различных клеток КМ. Для подсчета миелограммы в разных тонких участках 3−5 мазков дифференцируют не менее 500 (лучше 1000) миелокарио­цитов. Подсчитывают все встречающиеся в поле зрения элементы.

После подсчета 500 клеток делят число клеток каждого вида на 5 (при подсчете 1000 клеток − на 10) и выдают ответ в процентах. При оценке пунктатов КМ, кроме процентного содержания клеточных элементов, учитывают соотношение раз­личных групп клеток − рассчитывают костномозговые индексы.

1. Лейко-эритробластическое отношение (Л/Э, Л:Э) − отно­шение суммы клеток лейкоцитарного ряда к сумме клеток эритроцитарного ряда:

Миелобласты + промиелоциты + нейтрофилы + базофилы + моноциты + лимфоциты / эритробласты + базофильные нормобласты + полихроматофильные нормобласты + оксифильные нормобласты. В норме Л/Э равно 2,1/1 − 4,5/1.

2. Костно-мозговой индекс нейтрофилов учитывает соотношение молодых и более зрелых форм нейтрофилов: Промиелоциты + миелоциты + метамиелоциты / Палочкоядерные + сегментоядерные. Норма: 0,5−0,9.

3. Индекс созревания эритрокариоцитов - отношение гемоглобинсодержащих нормобластов ко всем клеткам эритроцитарного ряда: Полихроматофильные нормобласты + оксифильные нормобласты / Эритробласты + базофильные нормобласты + полихроматофильные нормобла­сты + оксифильные нормобласты. Норма: 0,7−0,9.

В описательной части миелограммы указывают кол-во ядросодержащих клеток в препаратах; количество мегакариоци­тов (умеренное, в большом количестве, встречаются редко, не найдены), их функциональную активность; наличие атипичных клеток; клеточных скоплений; дегенеративные изменения клеток. При оценке миелограммы важно сопоставить картину кост­ного мозга с картиной периферической крови. В некоторых слу­чаях для уточнения диагноза прибегают к трепанобиопсии.