II Количественное определение живых бактериальных клеток в иммунобиологических препаратах

Иммунобиологическое ЛС - это биологическое ЛС, предназначенное для иммунобиологической профилактики, диагностики и лечения заболеваний, а также биологическое ЛС, полученное путем переработки неклеточной части крови, оказывающее лечебный и профилактический эффект через иммунную систему.

К иммунобиологическим препаратам относятся: вакцины, анатоксины, иммуноглобулины, сыворотки, интерфероны, аллергены, бактериофаги, пробиотики (эубиотики), и другие.

Иммунобиологические препараты могут получать путем:

•культивирования штаммов микроорганизмов и клеток эукариот,

•экстракции веществ из биологических тканей и крови, включая ткани и кровь человека, животных и растений,

•применения технологии рекомбинантной ДНК, гибридомной технологии,

•репродукции живых агентов в эмбрионах или организме животных.

Пробиотики – препараты из живых микроорганизмов - нормальных «обитателей» кишечного тракта здорового человека - и веществ микробного происхождения, оказывающие при естественном пути введения положительный эффект через регуляцию микрофлоры кишечника.

Термин «пробиотик», от латинского pro bio — «для жизни», был предложен Lilly D.M. и Stilwell R.H. в 1965 году как альтернатива термину «антибиотики», означающему «против жизни».

Современное определение пробиотиков было дано ВОЗ в 2002 г: «Пробиотики — это живые микроорганизмы, которые при применении в адекватных количествах вызывают улучшение здоровья организма- хозяина»

Полезное действие пробиотиков и пробиотических продуктов известно с начала ХХ в., когда И.И. Мечниковым была создана простокваша с живыми ацидофильными бактериями.

«Наша преждевременная и несчастливая старость является следствием постоянного отравления вредными веществами, выделяемыми некоторыми микробами толстого кишечника. Совершенно очевидно, что уменьшение количества этих микробов отдаляет старость и смягчает ее проявления» — говорил И.И. Мечников, наблюдая как болгары, постоянно употреблявшие в пищу «болгарский йогурт» (кисломолочный продукт), отличались долголетием и хорошим здоровьем.

Затем, в 1907 году ученый разрабатывает концепцию, в основе которой лежит изучение нормальной микрофлоры организма человека, а употребление молочнокислых продуктов в пищу (т. е., бактерий, содержащихся в них и формирующих защитную функцию организма) — практический шаг к продлению и улучшению качества жизни. Это было началом эры пробиотиков.

Широкое применение препаратов, содержащих лактобактерии и бифидобактерии — пробиотиков - берет начало с 30-х годов 20-го века.

Пробиотики могут быть ЛС, пищевыми добавками, пищевыми продуктами. В отношении пищевых добавок и пищевых продуктов-пробиотиков не существует строгих норм и правил производства, которые должен выполнять производитель. В США пробиотики находятся за пределами компетенции Управления по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств (FDA). В Республике Беларусь пробиотики относятся как к ЛС, так и к БАДам.

Требования к микроорганизмам, входящим в состав пробиотиков (Продовольственная и сельскохозяйственная организация при ООН (Food and Agriculture organization of the United Nations — FAO) и ВОЗ (2002 г.):

•Непатогенность и нетоксичность;

•Способность выживать в кишечнике;

•Способность сохранять стабильность состава и жизнедеятельность в течение всего срока хранения;

•Присутствие живых клеток, которые обладают высокой адгезивной и антагонистической способностью к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам;

•Не должны угнетать нормальную микрофлору кишечника;

•Наличие генетического паспорта и доказательство генетической стабильности.

Фармакологические свойства пробиотиков:

1. Антагонистически (несовместимо с жизнью) действуют в отношении патогенных, условно патогенных бактерий, дрожжей, грибов, вирусов.

2. Улучшают нарушенный баланс микроорганизмов в ЖКТ, устраняют дисбиоз (количественные и качественные изменения состава кишечной микрофлоры) и дисбактериоз (качественное изменение бактериальной микрофлоры организма, преимущественно кишечника).

3. Выполняют защитную и детоксикационную (помогают очищать организм) роль по отношению к радиационному воздействию, химическим загрязнителям пищи, канцерогенным и токсическим веществам, экзотической и непривычной пище.

4. Продуцируют витамины (К и группы В), расщепляют желчные кислоты, холестерин и координирует его уровень.

5. Оптимизирует процесс пищеварения, моторную функцию кишечника.

6. Способствуют активизации иммунной системы.

Микроорганизмы, используемые в качестве пробиотиков:

• Лактобактерии (L. acidophilus, L. plantarum, L. casei, L. bulgaricus, L. lactis, L. reuteri, L. rhamnosus, L. fermentum, L. jonsonii, L. gassed);

• Бифидобактерии (B. bifidum, B. infantis, B. longum, B. breve, B. adolescents);

• Непатогенные разновидности Escherichia сoli;

• Непатогенные разновидности спорообразующих бактерий Bacillus (В. subtilis);

• Непатогенные разновидности Enterococcus (Enterococci faecium, Е. salivarius);

• Дрожжевые грибки (Saccharomyces boulardii).

Виды пробиотиков в зависимости от состава:

• Монокомпонентные – содержат только один вид бактерий: Лактобактерин, Бифидумбактерин, Бактолакт, Бактисубтил

• Поликомпонентные – включают несколько видов живых микроорганизмов: Линекс, Ацилакт, Лактобациллин, Энтерожермина

• Комбинированные (симбиотики) – содержат как живые бактерии, так и пребиотики: Бифилиз, Полибактерин.

Пребиотики – вещества, которые не всасываются в тонкой кишке, но стимулируют рост и метаболическую активность представителей нормальной микробиоты толстого кишечника. Пребиотики, в отличие от пробиотиков, – это химические вещества, которые содержатся в довольно широком спектре продуктов питания. Наибольшее количество пребиотиков содержится в молочных продуктах, кукурузе, крупах, хлебе, луке, чесноке, фасоли, горохе, артишоке, аспарагусе, бананах

К пребиотикам относятся следующие органические соединения:

-Инулин;

-Пантотенат кальция;

- Лактулоза;

- Пектины;

- Декстрин;

- Каротиноиды и др.

Виды пробиотиков в зависимости от технологии получения:

• Сухие - это лиофилизированные (высушенные) микроорганизмы, которые могут находиться в порошке, капсулах, таблетках. Преимущество – длительный срок хранения Недостаток - после употребления сухого пробиотика необходимо от 1 до 4 часов для выхода бактерий из анабиоза (спящего состояния) после чего препарат начинает проявлять своё действие (адгезию, антагонизм и т. д.).

• Жидкие - это первоначальная, не подвергшаяся лиофилизации (сушке) форма пробиотиков. Жидкие пробиотики состоят из:

- Бактерий или других микроорганизмов, находящихся в физиологически активном состоянии

- Специальной питательно й среды (питательная среда служит источником питания физиологически активных бактерий, которые находятся во флаконе).

- Дополнительно введённых ингредиентов, усиливающих эффективность препарата: водорастворимые витамины, микро- и макроэлементы, аминокислоты и т. д.

- Метаболитов.

Метаболиты — это продукты жизнедеятельности микроорганизмов (микроорганизмы, находясь в физиологически активном состоянии, поедают питательную среду во флаконе, в результате чего, функционируя, выделяют метаболиты, необходимые организму). Преимущество - при попадании в организм действуют немедленно Недостаток – менее длительный срок хранения.

Фармакологическая активность препаратов-пробиотиков зависит от количества и состояния входящих в их состав микробных клеток. Поэтому количество жизнеспособных клеток в одной терапевтической дозе таких лекарственных средств является одним из основных показателей качества. Как правило, одна доза лекарственного средства-пробиотика должна содержать не менее 10 7 живых бактериальных клеток.

Определение титра жизнеспособных клеток, как правило, проводят следующим способом:

• Приготовление серии десятикратных разведений с учетом предполагаемого титра в готовой лекарственной форме;

• Посев на соответствующую питательную среду, культивирование, подсчет выросших колоний микроорганизмов и определение тира клеток.

Классификация фармацевтической продукции по уровню микробной контаминации. Роль микроорганизмов-контаминантов лекарственных средств в патологии человека. Основные задачи микробиологического контроля нестерильной продукции. Требования к микробиологической чистоте нестерильных лекарственных средств (неводных и водных препаратов для внутреннего применения, средств для кожного применения) и нестерильных фармацевтических субстанций (международные и национальные требования).

Уровень микробной чистоты – один из основных показателей качества фармацевтической продукции.

По этому показателю все препараты делят на:

• Стерильные – препараты, в которых не допускается содержание жизнеспособных клеток микроорганизмов (~ 20 % от общего количества ЛС);

• Нестерильные – препараты, в которых допускается содержание живых микроорганизмов, требования к количеству и качественному составу которых зависит от лекарственной формы и способа введения препарата и нормируется соответствующей документацией (ГФ РБ, ФСП РБ) (~ 80 % от общего количества ЛС).

Важность микробиологического контроля в фармацевтическом производстве обусловлена ​​последствиями присутствия микроорганизмов как в стерильных, так и в нестерильных ЛС, создающими опасность для здоровья и жизни человека.

Роль микроорганизмов- контаминантов ЛС в патологии человека:

•Могут приводить к серьезным инфекционным заболеваниям или к отравлению организма вследствие образования токсинов;

•Могут приводить к биодеградации ЛС, в частности действующих веществ (АФИ), - в результате происходит снижение либо отсутствие терапевтического действия препарата;

•Способствуют появлению и распространению лекарственной устойчивости – способности сохранять жизнедеятельность несмотря на контакт с химиопрепаратами.

Природа заболеваний, вызываемых микроорганизмами-контаминантами ЛС:

•Неинфекционные: обусловленные продуктами биодеградации АФИ

•Инфекционные: вызываемые проникновением в организм патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

- Токсикозы - заболевания, вызываемые энтерально действующими экзотоксинами микроорганизмов (S. aureus, C.botulinum.)

-Токсикоинфекции — заболевания, вызываемые эндотоксинами микроорганизмов (B. cereus, род Klebsiella).

Возникновение, развитие и исход заболевания зависят:

•от уровня микробной контаминации;

•вирулентности микроорганизма- контаминанта;

•резистентности человека;

•способа введения препарата.

Для стерильных ЛС наличие микроорганизмов даже в малом количестве может стать летальным, учитывая беспрепятственное попадание микроорганизмов в кровь или на слизистые оболочки, при условии ослабленного иммунитета человека. При местном применении вероятность развития инфекционного процесса резко возрастает при обширных повреждениях тканей в результате травмы, ожога, хирургического вмешательства.

Например: Staphylococcus aureus при попадании с контаминированным ЛС •на кожу или слизистые может вызывать гнойно-воспалительные процессы

•при ингаляционном введении – стафилококковую пневмонию

•при пероральном введении – токсико- инфекцию

•при попадании в кровяное русло – генерализованную инфекцию (сепсис).

Вывод: нормирование относительно стерильности и микробиологической чистоты ЛС, регламентированное требованиями фармакопеи, предназначено для защиты потребителей ЛС от возможных последствий их контаминации микроорганизмами.

Историческая справка

Оценка вероятности микробной контаминации нестерильных лекарственных средств во всем мире стала проводиться после фактического доказательства возможности инфицирования потребителей препаратами, загрязненными патогенными микроорганизмами.

• В 1966 г. в Швеции была зарегистрирована вспышка инфицирования сальмонеллезом, возникшая в результате использования загрязненного препарата.

Пострадали более 200 человек. • Установлено негативное деструктивное влияние продуктов жизнедеятельности бактерий и грибов на стабильность и эффективность лекарственных препаратов.

• ВОЗ принимает рекомендации по введению максимально допустимого уровня микробной контаминации нестерильных лекарственных средств.

• Конец 60-х годов 20-го века - нормы по микробиологической чистоте лекарственных средств начали устанавливаться в нормативных документах Великобритании, Европы и США.

• Для разработки условий проведения микробиологических исследований лекарственных средств были привлечены специалисты-микробиологи в области методологии испытаний в пищевой и санитарной микробиологии.

• Но определенные физико-химические и биологические свойства лекарственных средств требовали введения новейших подходов к определению их микробиоты.

• С 1968 г. постепенно вносились изменения, в том числе в методы и условия проведения микробиологических исследований по контролю качества лекарственных средств

• В странах бывшего Советского Союза контроль ЛС по микробиологическим показателям долгое время проходил по требованиям инструкций 70-х годов ХХ столетия, которые, в отличие от рекомендаций ВОЗ, включали другие подходы к методологии выявления микробиоты в ЛС, что не согласовывалось с требованиями ведущих фармакопей мира.

Тем не менее:

- По результатам анализов, выполненных в период с 1973 по 1975 гг. из 5000 препаратов 65% не удовлетворяло предъявляемым требованиям по уровню обсемененности, 12% - содержали патогенные микроорганизмы.

- В 1979г. только 30% проверенных препаратов не соответствовали требованиям и лишь 0,9% содержали патогенные микроорганизмы.

• 1989 г. - первые шаги в направлении создания микробиологического контроля ЛС, выход Государственной фармакопеи СССР ХІ издания (выпуск 2), которая впервые содержала требования к определению качества лекарственных средств по показателям «Стерильность» и «Микробиологическая чистота», которые соответствовали рекомендациям ВОЗ.

• 1996 г. - дополнения № 1 к ГФ ХІ, которое стало основным документом, на котором базировался микробиологический контроль фармацевтической продукции отечественных предприятий. • За последние 30 лет в европейских странах и США неоднократно менялись требования, предъявляемые к нестерильным лекарственным средствам по показателю «Микробиологическая чистота». Результатом этой работы стали международные и национальные стандарты (Фармакопея США, Европейская фармакопея, Британская фармакопея, ГФ РБ, ГФУ, ГФ XII), четко регламентирующие требования к уровню содержания в фармацевтической продукции микроорганизмов и проведение исследований по определению микробиологической чистоты лекарственных средств.

Основные задачи микробиологического контроля нестерильной продукции:

1. Имеются ли в образце жизнеспособные микроорганизмы (бактерии, грибы)? (качественный анализ)

2. Если да, то в каком количестве? (количественный анализ)

3. Что именно? (идентификационный анализ). Для ответа на поставленные вопросы используют только фармакопейные методы. Микробиологические требования к нестерильной продукции:

- должна содержать ограниченное количество микроорганизмов;

- не должна содержать определенные виды микроорганизмов;

- допустимое количество и виды микроорганизмов зависят от лекарственной формы и пути введения препарата;

Критерии приемлемости для микробиологической чистоты нестерильных лекарственных средств. (ГФ РБ т.1, изд-е 2 раздел 5.1.4.)

Интерпретация критериев приемлемости:

- 10 1 КОЕ: максимально допустимое число = 20;

- 10 2 КОЕ: максимально допустимое число = 200;

-10 3 КОЕ: максимально допустимое число = 2000.