Антимикробное действие фармацевтической продукции (специфическое и неспецифическое). Проверка наличия антимикробного действия нестерильной фармацевтической продукции и способы его устранения.

2. Проверка наличия/отсутствия антими- кробного действия ЛС (АФИ, вспомога- тельного вещества).

1. Некоторые ЛС (АФИ, вспомогательные вещества) обладают выраженным антимикробным действием:

•Специфическое антимикробное действие: антибиотики, антисептики, производные фторхинолонов, сульфаниламиды и др. – т.е. вещества и препараты из них, предназначенные для лечения инфекционных заболеваний.

•Неспецифическое антимикробное действие: цитостатики, спирты, S-содержащие препараты, некоторые анальгетики и др. – т.е. вещества и препараты из них, непосредственно не предназначенные для лечения инфекционных процессов, но обладающие сопутствующим антимикробным действием.

2. Наличие антимикробного действия ЛС проверяется в тех же условиях, что и определение микробиологической чистоты, с использованием тест-культур, применяемых для проверки ростовых свойств питательных сред.

3. В основе метода определения антимикробного действия лежит сравнение интенсивности роста тест-микроорганизмов в присутствии и в отсутствие испытуемого продукта (АФИ, вспомогательного вещества, ЛС).

4. Приготовление испытуемого образца: • водорастворимые продукты: растворяют или разводят (обычно в соотношении 1:10) в буфере или питательной среде (ГФ РБ). • нерастворимые в воде продукты: суспендируют (обычно в соотношении 1:10) в буфере или питательной среде (ГФ РБ). •жиры: - продукт растворяют в небольшом количестве стерильного изопропилмиристата или смешивают с небольшим количеством ПАВ, нагретого до 40 - 45°С. При необходимости поддерживают температуру в водяной бане; - добавляют предварительно подогретый до нужной температуры разбавитель до получения разведения продукта 1:10, перемешивают до образования эмульсии.

5. Контроль – растворитель, используемый для приготовления образца ЛС (буфер или питательная среда – ГФ РБ).

6. Инокуляция образца и контроля, высев на питательные среды:

• Испытуемый образец и контроль инокулируют суспензией тест-микроорганизма в количестве ~100 КОЕ.

•Объем суспензии микроорганизма не должен превышать 1% объема образца или контроля.

•Делают высев на чашки Петри глубинным или поверхностным способом, инкубируют. Для каждого микроорганизма используют не менее 2-х чашек.

7.Отрицательный контроль: контролю подвергается растворитель, используемый для приготовления исходной и рабочей суспезий тест-микрорганизмов, путем высева на питательные среды. Не должно наблюдаться роста микроорганизмов.

8.Учет роста и интерпретация результатов: • Подсчитывают количество выросших колоний бактерий и грибов в чашках с добавлением образца препарата и контроля, рассчитывают среднее арифметическое.

• Если среднее количество колоний в чашках с испытуемым образцом отличается от среднего количества колоний в чашках с контролем менее чем в 2 раза (процент восстановления – более 50%), то считается, что продукт не обладает антимикробным действием.

• В противном случае продукт обладает антимикробным действием, необходимо его устранить (нейтрализовать).

3. Нейтрализация (устранение) антимикробного действия:

•Разведения исходного образца.

•Добавление нейтрализующего агента (специфического или неспецифического) в растворитель.

•Комбинация двух методов.

•Мембранная фильтрация.

Разведение исходного образца - используют тот же растворитель, что и для приготовления образца ЛС (буфер или питательную среду); - разведение должно проводиться с учетом критериев приемлемости по содержанию микроорганизмов в продукте. Например: если содержание ОКА – 10 3 КОЕ/г, а ОКГ – 10 2 КОЕ/г, то последнее допустимое разведение образца для устранения антимикробного действия составит – 1:500 для бактерий и 1:50 для грибов (при посеве 1 мл образца с культурой глубинным способом); - если желаемый результат достигается при минимальном разведении, используют это разведение; - контроль, отрицательный контроль, проведение испытания и интерпретацию результатов - аналогично как при

«Проверка наличия/отсутствия антимикробного действия ЛС». Добавление нейтрализующего агента - перечень возможных неспецифических нейтрализующих агентов: натрия гидросульфит, глицин, лецитин, полисорбат, тиогликолят, тиосульфат, ионы Mg, Ca; -специфические инактиваторы: β-лактамаза (пенициллиназа) – для β-лактамных антибиотиков (пенициллинов, цефалоспоринов, карбапенемов и монобактамов), парааминобензойная кислота – для сульфаниламидов и др. - необходимо подтвердить эффективность и отсутствие токсичного действия нейтрализующих агентов на микроорганизмы в испытаниях без испытуемого продукта; - проведение испытания, учет и интерпретация результатов – аналогично проверке наличия антимикробного действия

Комбинация методов:

Метод разведения + применение нейтрализующих агентов

Мембранная фильтрация -используют установку мембранной фильтрации с мембранными фильтрами с номинальным размером пор – 0,45 мкм; - образец ЛС готовят по стандартной процедуре так, чтобы на фильтр нанести 1 г испытуемого средства, и добавляют ~ 100 КОЕ каждого из тест-микрорганизмов; - полученный испытуемый образец переносят на мембранный фильтр, фильтруют и промывают фильтр подходящим объемом того же растворителя (не более 5 раз по 100мл); - контроль: ~ 100 КОЕ каждого из тест- микрорганизмов в том же растворителе; - для определения ОКА и ОКГ мембранные фильтры переносят на чашки с соответствующими питательными средами и инкубируют в подходящих условиях; - для определения специфических микроорганизмов – соответственно на селективные среды - проводят подсчет выросших колоний и интерпретацию результатов аналогично определению антимикробного действия чашечным методом. Не найден подходящий метод нейтрализации:

- бактерицидное действие продукта в отношении тест- микроорганизмы.

Следовательно, продукт не может быть контаминирован данными видами микроорганизма; - продукт ингибирует только определенные (используемые в испытании) виды микроорганизмов и не ингибирует другие. Испытание проводят с большим коэффициентом разведения с учетом критериев приемлемости для выявления устойчивых штаммов.

Алгоритм определения микробиологической чистоты нестерильной фармацевтической продукции. Определение микробиологической чистоты методом мембранной фильтрации и методом прямого посева на агаризованную среду в чашках Петри. Выявление специфических микроорганизмов (на примере E. сoli).

Определение микробиологической чистоты ЛС (АФИ, вспомогательных веществ) (ОКА и ОКГ)

• Количество испытуемого образца: чем больше масса образца, тем выше статистическая достоверность вывода об отсутствии патогенных микроорганизмов.

Если иное не указано в частной статье, используют 10 г или 10 мл испытуемого продукта Количество может быть уменьшено - для АФИ, содержание которых в ЛС очень мало - ≤ 1 мг в дозированной единице (таблетке, капсуле) и недозированной единице (мл или г). В этом случае количество испытуемого образца должно быть не менее чем количество, содержащееся в 10 дозированных единицах или 10 г (10 мл) продукта; - для АФИ, количество которых ограничено или объем серии очень мал (1000 мл или 1000г). Количество образца для испытания – 1% от размера серии; - для ЛС, общее количество в серии которых менее 200 единиц (например, для клинических испытаний). Размер отбираемого для контроля образца – 2 единицы.

Мембранная фильтрация:

- готовят образец из 10 г продукта (растворяют в отношении 1:10 в буфере или питательной среде – ГФ РБ) с учетом результатов испытаний по определению антимикробного действия; - количество образца, эквивалентное 1 г исходного продукта, наносят на каждый из двух мембранных фильтров и немедленно фильтруют, при необходимости промывают; - для определения ОКА один из мембранных фильтров переносят на поверхность агаризованной среды на основе гидролизата казеина и соевых бобов (или №1). Чашки инкубируют в течение 3-5 суток при температуре 30 - 35°С; - для определения ОКГ второй из мембранных фильтров переносят на поверхность декстрозного агара Сабуро (или №2). Чашки инкубируют в течение 5-7 суток при температуре 20-25°С - рассчитывают число КОЕ (ОКА и ОКГ) в 1г или 1 мл испытуемого продукта и делают вывод о соответствии его качества требованиям спецификации.

• Метод чашечного подсчета:

- готовят образец из 10 г продукта с учетом результатов испытаний по определению устранению антимикробного действия; - для каждой питательной среды (для выявления ОКА и ОКГ) готовят не менее 2-х чашек Петри для каждого уровня разведений; - посевы делают глубинным или поверхностным способом; - инкубируют посевы аналогично как и д мембранной фильтрации; - для подсчета колоний отбирают чашки максимальным количеством колоний не более 250 для определения ОКА и не более 50 для определения ОКГ. Рассчитывают среднее арифметическое значение числа колоний для каждого разведения и определяют количество КОЕ в 1 г или 1 мл испытуемого продукта Делают вывод о соответствии его качества критериям приемлемости. - отрицательный контроль: контролю подвергается растворитель, используемый для приготовления раствора/суспезий испытуемого продукта, путем высева на питательные среды Не должно наблюдаться роста

• Если на агаризованной питательной среде для выявления бактерий обнаруживаются колонии грибов, они рассчитываются как часть общего количества аэробов (ОКА).

• Если на агаризованной питательной среде для выявления грибов обнаруживается рост колоний бактерий, они рассчитываются как общее количество грибов (ОКГ).

Определение микробиологической чистоты: испытания на наличие специфических микроорганизмов

Пример: выявление Escherichia coli (метод чашечного подсчета)

1. Образец готовят аналогично как и для выявления ОКА и ОКГ

2. Испытанию подвергают количество, эквивалентное 1 г или 1 мл продукта

3. Инокулируют подходящее количество бульона на основе гидролизата казеина и соевых бобов, перемешивают, инкубируют при температуре 30-35°С в течение 18-24 ч.

4. Встряхивают контейнер, переносят 1 мл образца, полученного при выполнении п.3, в 100 мл бульона Макконки и инкубируют при температуре 42-44°С в течение 24 - 48 ч. - обогащение

5. Пересевают подходящее количество образца, полученного при выполнении п.4, на чашки с агаром Макконки и инкубируют при температуре 30-35°С в течение 18-72 ч. – индикация

6. Интерпретация результатов: рост характерных колоний свидетельствует о возможном присутствии Escherichia coli.

Результат подтверждается идентификационными испытаниями. 7. Продукт выдерживает испытания, если подобные колонии не обнаруживаются или испытания идентификации дают отрицательный результат.

При проведении испытания методом мембранной фильтрации приготовленный образец фильтруют через мембранный фильтр, который помещают в бульон на основе гидролизата казеина и соевых бобов, перемешивают, инкубируют при температуре 30-35°С в течение 18-24 ч. далее: аналогично пп. 4-7.

Стерильность фармацевтической продукции, группы стерильных препаратов. Условия для проведения испытания по определению стерильности. Методы определения стерильности, их преимущества и ограничения.

Стерильность – отсутствие живых микроорганизмов.

Для стерильных лекарственных форм наличие микроорганизмов, даже в малом количестве, может стать летальным, учитывая беспрепятственное попадание микроорганизмов в кровь или на слизистые оболочки организма, при условии ослабленного иммунитета человека.

Впервые тест на определение стерильности лекарственных средств был внесен в фармакопеи Великобритании и США в 1932 и 1936 годах соответственно.

Цель испытания на стерильность – подтверждение полного отсутствия жизнеспособных бактерий и грибов в испытуемом объекте (АФИ, ЛС).

Испытание применяется для препаратов, которые должны быть стерильны:

•ЛС для парентерального применения (растворы, лиофильно высушенные и стерильно расфасованные порошки для инъекций и инфузий);

•Офтальмологические ЛС;

•Растворы антисептиков для наружного применения;

•Мази, гели для наружного применения (для нанесения на раневую поверхность);

•АФИ, предназначенные для производства ЛС в форме стерильно расфасованных порошков и др.

Однако: удовлетворительный результат испытания свидетельствует лишь о том, что в условиях испытания в испытуемом образце не обнаружено микроорганизмов.

Для стерильных продуктов обоснованные и документированные фактические доказательства правильного протекания процесса их приготовления дают большую гарантию по сравнению с испытанием на стерильность.

Условия для проведения испытания по определению стерильности:

• Испытания на стерильность должны проводиться в тех же условиях, что и асептическое производство: при использовании ламинар-боксов с ламинарным потоком воздуха класса А, расположенной в чистом помещении класса В, или с помощью изолятора.

• Подготовка воздуха, подаваемого в чистое помещение, с помощью НЕРА-фильтров (HEPA - High Efficiency Particulate Absorption - высокоэффективная задержка частиц). Эти фильтры служат для практически полной очистки воздуха даже от самых мельчайших частиц, вплоть до 0.1 мкм.

• Доступ к помещению должен быть организован через воздушные шлюзы – конструкции с однонаправленными односторонними путями прохождения. Воздушный шлюз предотвращает перемещение воздуха между помещениями. Когда все двери воздушного шлюза закрыты, подаваемый в него воздух разбавляет загрязнения, поступившие из наружного коридора через дверь, либо выделяемые присутствующим персоналом.

• Испытуемая продукция должна подаваться через передаточные окна.

• Исполнители должны быть переодеты в стерильную одежду.

• Исполнители должны пройти соответствующую подготовку.

• Меры предосторожности, принимаемые против контаминации, не должны влиять ни на один из микроорганизмов, которые могут быть обнаружены в ходе испытания.

• Условия, в которых проводятся испытания, должны регулярно контролироваться путем отбора проб воздуха и поверхностей рабочей зоны.

Методы определения стерильности:

• Мембранная фильтрация

– наиболее предпочтительный метод, если испытуемый препарат фильтруется;

• Метод прямого посева.

Прямой Посев

• Преимущества

- Быстрый, простой, экономичный

- Нефильтруемые образцы

• Ограничения

- Ограниченный объем образца: низкая чувствительность

- Проблемы с антимикробным действием

Мембранная Фильтрация

• Преимущества

- Возможность эффективного устранения антимикробного действия

- Высокая надежность выявления нестерильности антимикробных препаратов из-за отсутствия разбавления, что имеет место при устранении антимикробного действия.

- Возможность фильтрования большого объема

- Статистически более достоверен

- Более чувствителен: высокая эффективность

выявления микробной контаминации при низкой концентрации клеток в единице образца благодаря возможности концентрирования или удержания на мембране даже единичных клеток (1 КОЕ на образец)

• Ограничения - Нефильтруемые образцы, закупоривание Мембраны

 

Питательные среды, используемые для определения стерильности фармацевтической продукции. Проверка пригодности питательных сред. Проверка наличия антимикробного действия стерильных препаратов и способы его устранения.

Питательные среды, используемые для определения стерильности:

• Жидкая тиогликолевая среда: снижает окислительно-восстановительный потенциал и способствует росту анаэробных микроорганизмов

- Выявление анаэробных бактерий

- Аэробных бактерий

• Жидкая среда на основе гидролизата казеина и соевых бобов (# среда Сабуро):

- Выявление грибов

- Выявление аэробных бактерий.