Тонкослойная хроматография. Общие принципы. Адсорбенты. Подвижная фаза. Проявление хроматограмм. Обнаружение хроматографических зон.

Тонкослойная хроматография (ТСХ, TLC) - один из наиболее используемых методов хроматографического анализа, но наименее популяризируемый.
Основой тонкослойной хроматографии является адсорбционный метод, хотя также встречается метод распределительной хроматографии.

Адсорбционный метод основан на различии степени сорбции-десорбции разделяемых компонентов на не подвижной фазе.
Адсорбция осуществляется за счет ван-дер-вальсовских сил, являющейся основой физической адсорбции, полимолекулярной (образование нескольких слоев адсорбата на поверхности адсорбента) и хемосорбцией (химического взаимодействия адсорбента и адсорбата).
Для эффективных процессов сорбции-десорбции необходима большая площадь, что предъявляет определенные требования к адсорбенту. При большой поверхности разделения фаз происходит быстрое установление равновесия между фазами компонентов смеси и эффективное разделение.
Так физическое выражение адсорбции-десорбции в упрощенном виде можно выразить уравнением:

Г=(Г^~/К)с.

где Г^~ -предельно возможная величина адсорбции, К- константа равновесия; с-концентрация абсорбата.

В более строгих подходах к теории адсорбции необходимо учитывать взаимодействие между адсорбированными частицами, неоднородность поверхности, давление, температуру и т.д.
Но как видно из вышеописанного уравнения - адсорбция является линейной функцией концентрации.

Еще одним видом используемом в методе тонкослойной хроматографии является распределительная жидкостная хроматография.
В распределительной хроматографии обе фазы - подвижная и неподвижная - жидкости, не смешивающиеся друг с другом. Разделение веществ основано на различии в их коэффициентах распределения между этими фазами.
Впервые метод тонкослойной хроматографии заявил о себе как "Бумажная тонкослойная хроматография", которая основывалась на распределительном методе разделения компонентов.

Тонкослойная хроматография

Хроматографирование веществ происходит в тонком слое сорбента, нанесенного на твердую плоскую подложку. Разделение в этом методе в основном происходит на основе сорбции-десорбции.
Использование различных сорбентов, позволило значительно расширить и улучшить этот метод.
В начале появления метода пластины приходилось изготавливать самостоятельно. Но на сегодняшний день в основном используются пластины заводского изготовления, имеющие достаточно широкий ассортимент как по размерам и носителям, так и по подложкам.
Современная хроматографическая пластинка представляет собой основу из стекла, алюминия или полимера (например, политерефталат).
В связи с тем, что стеклянная основа становится менее популярной (часто бьется, нельзя разделить пластинку на несколько частей не повредив слой сорбента, тяжелая по весу), наибольшее распространение получили пластины, в качестве основ которых используют алюминиевую фольгу или полимеры.
Для закрепления сорбента применяют гипс, крахмал, силиказоль и др., которые удерживают зерна сорбента на подложке. Толщина слоя может быть различна (100 и более мкм), но самый важный критерий - слой должен быть равномерный по толщине в любом месте хроматографической пластинки.

Получение хроматограммы:

Под получением понимают формирование распределения вещества внутри хроматогр-й колонки.

Хроматографический процесс прекращают, как только фронт подвижной фазы прошел всю длину хроматографической колонки.

При обычном проведении хроматографического процесса на бумаге или в тонких слоях растворитель попадает на сухой носитель. Это обусловливает вначале слишком медленное продвижение вещества.
Однако, как только фронт в конце концов перегонит вещество, этот недостаток устраняется.

Обнаружение хроматографических зон.

ВИЗУАЛЬНАЯ ОЦЕНКА

Обнаружение (детектирование) зон адсорбции после проведения качественной и полуколичественной ТСХ осуществляют следующими способами:

– в видимом и ультрафиолетовом свете (при определенной длине волны);

– опрыскиванием растворами обнаруживающих реагентов;

– выдерживанием в парах обнаруживающего реагента;

– погружением в растворы обнаруживающих реагентов с использованием для этих целей специальных камер.

Идентификация

Испытание на подлинность (идентификация) анализируемых веществ проводится при одновременном хроматографировании одинакового количества анализируемого вещества и стандартного образца на одной и той же хроматографической пластинке.

Основную зону адсорбции (пятно или полосу) на хроматограмме испытуемого раствора сравнивают с основной зоной адсорбции (пятном или полосой) на хроматограмме стандартного раствора (раствора сравнения), сравнивая окраску (цвет флуоресценции), размер и величину фактора R _f соответствующих зон адсорбции (ОФС «Хроматография»).

59. Тонкослойная хроматография. Выбор растворителей подвижных фаз. Определение величины R_f. Эффективность хроматографического разделения. Экстрагирование хроматографических зон.

Тонкослойная хроматография (ТСХ, TLC) - один из наиболее используемых методов хроматографического анализа, но наименее популяризируемый.
Основой тонкослойной хроматографии является адсорбционный метод, хотя также встречается метод распределительной хроматографии.

Адсорбционный метод основан на различии степени сорбции-десорбции разделяемых компонентов на не подвижной фазе.
Адсорбция осуществляется за счет ван-дер-вальсовских сил, являющейся основой физической адсорбции, полимолекулярной (образование нескольких слоев адсорбата на поверхности адсорбента) и хемосорбцией (химического взаимодействия адсорбента и адсорбата).
Для эффективных процессов сорбции-десорбции необходима большая площадь, что предъявляет определенные требования к адсорбенту. При большой поверхности разделения фаз происходит быстрое установление равновесия между фазами компонентов смеси и эффективное разделение.
Так физическое выражение адсорбции-десорбции в упрощенном виде можно выразить уравнением:

Г=(Г^~/К)с.

где Г^~ -предельно возможная величина адсорбции, К- константа равновесия; с-концентрация абсорбата.

В более строгих подходах к теории адсорбции необходимо учитывать взаимодействие между адсорбированными частицами, неоднородность поверхности, давление, температуру и т.д.
Но как видно из вышеописанного уравнения - адсорбция является линейной функцией концентрации.

Еще одним видом используемом в методе тонкослойной хроматографии является распределительная жидкостная хроматография.
В распределительной хроматографии обе фазы - подвижная и неподвижная - жидкости, не смешивающиеся друг с другом. Разделение веществ основано на различии в их коэффициентах распределения между этими фазами.
Впервые метод тонкослойной хроматографии заявил о себе как "Бумажная тонкослойная хроматография", которая основывалась на распределительном методе разделения компонентов.

Тонкослойная хроматография

Хроматографирование веществ происходит в тонком слое сорбента, нанесенного на твердую плоскую подложку. Разделение в этом методе в основном происходит на основе сорбции-десорбции.
Использование различных сорбентов, позволило значительно расширить и улучшить этот метод.
В начале появления метода пластины приходилось изготавливать самостоятельно. Но на сегодняшний день в основном используются пластины заводского изготовления, имеющие достаточно широкий ассортимент как по размерам и носителям, так и по подложкам.
Современная хроматографическая пластинка представляет собой основу из стекла, алюминия или полимера (например, политерефталат).
В связи с тем, что стеклянная основа становится менее популярной (часто бьется, нельзя разделить пластинку на несколько частей не повредив слой сорбента, тяжелая по весу), наибольшее распространение получили пластины, в качестве основ которых используют алюминиевую фольгу или полимеры.
Для закрепления сорбента применяют гипс, крахмал, силиказоль и др., которые удерживают зерна сорбента на подложке. Толщина слоя может быть различна (100 и более мкм), но самый важный критерий - слой должен быть равномерный по толщине в любом месте хроматографической пластинки.

Растворители

В тонкослойной хроматографии, в качестве подвижной фазы используют либо чистые вещества (этилацетат, бензол и т.п.), либо смеси веществ (системы) в определенном соотношении.
Подбор подвижной фазы (системы) проводится по следующим правилам:

· Выбирают такую систему, в которой разделяемые компоненты имеют небольшую растворимость(если растворимость вещества высокая, то вещества будут перемещаться с фронтом, при низкой растворимости - оставаться на старте).
При распределительной хроматографии или при использовании обращенных фаз, растворимость веществ должна быть выше в подвижной фазе, чем в неподвижной.

· Состав системы должен быть постоянным и легко воспроизводимым.

· Растворитель или компоненты системы не должны быть ядовитыми или дефицитными.

· Система должна полностью разделять вещества близкого строения, причем различия в Rf должно быть не менее 0,05.

· Система не должна вызывать химические изменения разделяемых компонентов.

· В выбранной системе анализируемые вещества должны иметь различные значения Rf и распределяться по всей длине хроматограммы. Желательно, чтобы значения Rf лежало в пределах 0,05-0,85.

· При выборе системы также необходимо учитывать природу разделяемых веществ. Так, при хроматографировании веществ, имеющих основные свойства, система не должна обладать кислотными свойствами и наоборот.

Эти рекомендации дают предварительную оценку выбранной системы. Последнее слово все равно остается за экспериментом.

Значение Rf

Одним из основных показателей в ТСХ является показатель Rf. Этот параметр является аналогией времени удерживания и зависит
как от свойств разделяемых веществ,
состава подвижной фазы и сорбента,
так и от физических параметров.

Определение значения Rf проводят как отношение расстояния, прошедшего веществом, к расстоянию, прошедшего фронтом растворителя

Rf = L/L₀

Значение Rf - величина безразмерная и имеет значение от 0 до 1. Однако в литературе нередко встречается такие показатели как hRf, Rf×100, которые являются тем же Rf, но умноженными на 100, для того, чтобы не оперировать десятичными значениями.
На значение Rf не влияет расстояние, пройденное фронтом растворителя, однако во многих методиках описывается прохождение фронта на расстояние 10 см. Это используется только для облечения расчетов Rf.
На практике, в начале определяют расстояние прошедшее фронтом растворителя: от линии старта (а не от края пластинки) до места, где находился фронт в момент окончания хроматографирования. Затем определяют расстояние от линии старта до пятна разделенного вещества. Во тут и оказывает влияние размер пятна! Ведь если пятно имеет круглую форму и небольшой размер, то полученное Rf имеет четкое значение. А если полученное пятно имеет большой размер или неправильную форму, то при определении Rf такого пятна, ошибка может достигнуть 0,1!
В случае распределительной хроматографии коэффициент распределения вещества и его Rf связано соотношением:

где Sп и Sн -площади поперечных сечений подвижной и неподвижной фазы.
Как мы видим, Коэффициент распределения, при постоянном отношении Sп/Sн есть величина пропорционально зависящая от Rf, и может быть определена через него.

Экстрагирование хроматографических зон:

Относится к методам второй группы (к методам первой группы относится определение разделенных веществ БЕЗ экстракции).

Способ оценки хроматограмм в тонких слоях, состоящий в опрыскивании окрашивающим реактивом с последующей экстракцией окрашенных веществ и фотометрическим определением, часто вызывает трудности.

Соотношение конц реактива и определяемого вещества различно в центре и у края хроматограф-го пятна, поэтому ход реакции мб различным.

Если можно локализовать разделенные вещества без их дальнейшего превращения, например, по их собственной флуоресценции или по поглощению в УФ на пластинках, покрытых флуоресцирующим составом, и если ПОСЛЕ экстракции вещества имеются в кол-вах, достаточных для применения физико-хим методов определения, то эт возможность следует использовать!

Во многих случаях после экстракции проводят фотометрическое определение в УФ области или, после окраски, в видимой области.

Вначале целесообразно определить холостую пробу путем обработки выбранного сорбента экстрагентом.

Например, для силикагеля Г в качестве сорбента и метанола в качестве экстрагирующего вещества при кол-ном определении в УФ области.

При экстракции силикагеля возникают трудности с применением гидрофильных экстрагентов. Силикагель в виде коллоида переходит в раствор, однако во многих случаях его можно отделить фильтрованием раствора через кизельгур.

Далее следует иметь в виду, что связующий материал, сульфат кальция, почти кол-но растворяется в воде.

После этих предварительных исследований следует определить, извлекается ли определяемое вещество выбранным экстрагентом полностью.

Для этого пробы вещества наносят на пластинку, покрытую соответствующим сорбентом.
Проведя сушку в условиях, соответствующих условиям проведения собственно хроматограф-го разделения, экстрагируют вещество и определяют экстрагированное кол-во, затем вычисляют ошибку, возникающую при повторении опыта.

 

В общем при надлежащем выборе экстрагента около 95% нанесенной пробы экстрагируется вновь. Следует только избегать длительной выдержки пластинок с нанесенной пробой перед разделением, поскольку при этом из-за весьма большой поверхности соприкосновения анализируемого вещества и сорбента под действием воздуха может произойти изменение анализируемой пробы.

Если после разделения и экстракции получают в УФ-области завышенные значения или разброс при определении холостых проб, то следует иметь в виду, что это мб связано с недостаточным удалением компонентов растворителя, поглощающих в УФ-области.