Новые механизмы биосинтеза АФК, активирующиеся при стрессе. Роль АФК в жизни растения помимо стрессовых реакций.

МЕХАНИЗМЫ ОБРАЗОВАНИЯ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В КЛЕТКЕ

В основном состоянии молекулярный кислород представляет собой относительно стабильную молекулу, спонтанно не реагирующую с различными макромолекулами. Это объясняется его электронной конфигурацией: основная форма кислорода в атмосфере (3О2) находится в триплетном состоянии. Однако аэробные организмы сталкиваются с постоянной опасностью, связанной с тем, что многие процессы с участием молекулярного кислорода сопровождаются образованием так называемых активных форм кислорода, АФК, обладающих чрезвычайно высокой реакционной способностью. В настоящее время к числу АФК относят производные кислорода радикальной природы (супероксид-радикал (анион-радикал) О2•-, гидроперекисный радикал НО2•, гидроксил-радикал НО•), а также его реактивные производные (перекись водорода Н2О2, синглетный кислород 1О2 и пероксинитрит)

Синглетный кислород (1О2) образуется в хлоропластах в результате взаимодействия молекулярного кислорода с хлорофиллом, возбужденным квантом света и находящимся в триплетном состоянии. Энергия, необходимая для этого перехода, составляет примерно 22 ккал/моль. В результате поглощения избыточной энергии (что часто имеет место в реальных условиях) происходит обращение спина одного электрона и формирование синглетного кислорода Образование супероксидного анион-радикала (О2•-) происходит в фотосистеме I (ФС I) и II (ФС II) хлоропластов и на комплексах дыхательной цепи в митохондриях, а также в ряде реакций, протекающих в пероксисомах (при окислении ксантина ксантиноксидазой). В ФС I появление супероксидного радикала происходит в реакции Мёллера и связано с работой 4Fe-4S-кластеров, ферредоксина и/или ферредоксин-НАДФН-редуктазы. Около 10-25% всего нециклического электронного потока может идти на образование супероксид-радикала. Генерация анион-радикала, кроме того, возможна на уровне реакционного центра ФС II, предположительно в QА и QВ сайтах. В митохондриях образование О2•- сопряжено с функционированием дыхательной электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) во внутренней митохондриальной мембране и захватом молекулярным кислородом электронов с гемов (b1 и b2) и относительно долгоживущих семихинонов в Qin-сайте. По некоторым оценкам, даже в физиологически оптимальных условиях примерно 2-5 % проходящих по ЭТЦ электронов идут на образование супероксидных радикалов. Кроме того, в определенных условиях (например, при окислении пиридиннуклеотидов и полифенолов) при физиологическом значении рН некоторые апопластные пероксидазы, проявляя свою оксидазную функцию, способны к образованию супероксидного анион-радикала. Установлено, что пероксидаза клеточной поверхности является одним из основных источников супероксидного радикала при отсечении корней от проростков пшеницы. О2.- является источником образования других, более токсичных активных форм кислорода.

Супероксидрадикал может протонироваться до гидропероксидного радикала в результате реакции (уравнение 1): О2.- +H+ = НО2• (1)

Дисмутация двух анион-радикалов приводит к образованию перекиси водорода H2О2 (уравнение 2): 2О2•- + 2Н+ = Н2О2 + О2 (2) Дисмутация может протекать спонтанно или при участии специфических ферментов - супероксиддисмутаз (СОД). В клетках СОД представлена тремя изоформами, которые различаются входящими в состав активных центров ионами металлов: CuZn-СОД, Mn-СОД и Fe-СОД. Механизм действия СОД включает последовательное восстановление и окисление металла активного центра фермента супероксидными анион-радикалами. Перекись водорода образуется не только в результате нейтрализации супероксид-радикала при участии СОД, но и во многих других реакциях, особенно интенсивно протекающих в пероксисомах и глиоксисомах. Например, при окислении гликолата - одного из продуктов фотосинтеза, образующегося в результате оксигеназной реакции, катализируемой рибулозобисфосфаткарбоксилазой-оксигеназой (РБФКО). Гликолат транспортируется в пероксисомы и окисляется гликолатоксидазой до глиоксилата с образованием перекиси. С образованием Н2О2 в пероксисомах идут реакции при участии флавиновых дегидрогеназ (ксантиноксидаза, альдегидоксидаза и др.). Распад запасных жиров и процесс β-окисления жирных кислот, протекающие в глиоксисомах, также сопровождаются образованием Н2О2. Как и в случае супероксидного анион-радикала, пероксидазы апопласта способны генерировать перекись в процессе реализации оксидазной функции. При этом изменение рН определяет соотношение пероксидазной и оксидазной активностей пероксидаз. Так, было показано, что пероксидаза клеточной стенки, способная к образованию перекиси водорода при нейтральном рН, восстанавливала свою пероксидазную функцию при смещении рН окружающего раствора в кислую сторону.

Супероксид-радикал и перекись водорода в присутствии ионов железа (Fe2+, Fe3+) и/или меди (Cu2+) могут вступать в реакции Фентона (уравнения 3, 4) и Габера-Вайса (Haber-Weiss) (уравнение 5) и образовывать гидроксильный радикал, который является самым мощным известным окислителем:

О2•- + Fe+3 (Cu+2) = О2 + Fe+2 (Cu+) (3)

Fe+2 (Cu+) + Н2О2 = Fe+3 (Cu+2) + НО. + НО- (4)

О2•- + Н2О2 = НО. + НО- + О2 (5)

Таким образом, появление активных форм кислорода в живом организме связано с протеканием метаболических реакций в различных клеточных компартментах.

 

БИОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА

Длительное время в научной литературе господствовало мнение о негативных функциях АФК. Однако накопленные данные позволяют говорить об их существенной физиологической роли в явлениях онтогенеза.

Во-первых, изменения в интенсивности образования АФК обусловливают активацию реакций, связанных с морфогенезом растений. Во-вторых, под контролем АФК находятся реакции сверхчувствительности и апоптоза. В частности, при патогенезе, благодаря реакции сверхчувствительности, вокруг патогена формируется зона из мертвых растительных клеток, насыщенных антимикробными соединениями. Кроме того, известно, что помимо прямого влияния на клетку токсичных соединений, возможно и опосредованное их воздействие на растение. Полагают, что, например, медь и цинк участвуют в регуляции программируемой смерти клеток - фундаментального процесса, обеспечивающего селективное и упорядоченное "удаление" клеток и, тем самым, играющего критическую роль в контроле над формированием и развитием организмов.

В-третьих, АФК и продукты окислительной модификации биомолекул, образующиеся под их воздействием, могут играть роль вторичных мессенджеров в сигнальной трансдукции в геном, в т.ч. при стрессе, что может быть связано с изменением редокс-потенциала различных сенсорных белков. АФК способны окислять редокс-чувствительные белки непосредственно или опосредованно через молекулы, контролирующие окислительно-восстановительное состояние клетки (глутатион, тиоредоксин. Изменяя степень окисленности/восстановленности серы в составе тиольных групп, или окисляя FeS-кластеры, АФК способны влиять на конформацию белковых молекул и, следовательно, - функциональную активность.

В настоящее время мало известно о специфичной сигнальной функции той или иной активной формы кислорода. При этом не вызывает сомнений невозможность выполнения сигнальных функций гидроксильным радикалом, что связано с чрезвычайно малым временем его жизни (10-9 с) и радиусом диффузии (100 Å). Аналогичные обстоятельства также свидетельствуют об отсутствии значительной роли супероксидного анион-радикала в этом процессе. Несмотря на присутствие данной активной формы кислорода практически во всех клеточных компартментах, а также на её способность к диффузии по анионным каналам через плазматические мембран. Наиболее детально изучена сигнальная роль Н2О2, что обусловлено относительно высокой стабильностью данной АФК. Так, установлено, что перекись водорода может активировать одну из изоформ киназы - представителя МАРК-каскада группы С Arabidopsis Кроме того, следует учитывать экспериментальные данные и теоретические обоснования того, что перекись водорода может оказывать прямое стимулирующее действие на рост растений, а также являться важным (если не главным) источником кислорода в ходе световых реакций фотосинтеза.

В научной литературе имеется много фактических данных об участии различных АФК в трансдукции сигналов, приводящих к активации ферментов-антиоксидантов и экспрессии их генов. Существует предположение о том, что так называемая окислительная вспышка (усиленная вне- или внутриклеточная продукция АФК) в первые минуты после воздействия фактора - является начальным событием в цепи передачи сигналов, которое запускает (включает) работу других механизмов защиты. Помимо указанных выше воздействий, оксигенированные производные выполняют и другие разнообразные регуляторные функции. Например, в ходе деградации липидов могут образовываться фитогормоны - жасмонат, метилжасмонат, абсцизовая кислота (АБК). Также появляется большая группа С6 и С12-соединений - так называемых оксилипинов, которые выполняют защитные, в т.ч. антимикробные, функции при действии биотических стрессоров. было выдвинуто предположение о возможности регуляции активности Н+-АТФазы плазмалеммы с помощью перекисного окисления липидов. Многие продукты окислительной деградации липидов способны изменять спектр синтезируемых растениями белков.

 

119. Важность Са²⁺-регуляции при стрессе. Кальций-связывающие сигнальные белки.

Давно установлена важная роль кальция в обмене веществ и его необходимость для роста растений.Ионы кальция оказывают большое влияние на мембранные структуры. На необходимость ионов Са2+ для стабилизации мембран указывалось достаточно давно. Было показано, что для образования поверхностной мембраны на эндоплазматической капле, изолированной из интерно- дальных клеток харовых водорослей, необходимо присутствие в окружающем растворе ионов Са2+. При удалении ионов кальция (например, при обработке хелатами или при отсутствии Са2+ в среде) от­мечается ослизнение корневых волосков, а также повышается проницаемость мембран к другим веществам. Ионы Са2+ изменяют и электрические свойства как искусственных, так и естественных мембран, уменьшая плотность заряда на мембранной поверхности. Недостаток Са2+ приводит к возрастанию вакуолизации, изменению хромосом, разрыву мембран ЭПР и других внутриклеточных компартментов.Значительная часть кальция в растениях содержится в клеточных стенках в форме пектатов, карбонатов, оксалатов, сульфатов или цитратов. Кристаллические соли кальция, чаще встречаются в вакуоли, чем в клеточной стенке.Известно, что кальций необходим для повышения устойчивости растений к различным стрессам (высоким и низким температурам, анаэробиозу, токсическому уровню ионов, низкому рН и др.), для повышения созревания плодов и т. д.; установлена также зависимость активности некоторых ферментов растительных клеток от кальция (например, а-амилазы, дегидрогеназ, пектиностеразы и др.).Са2+ необходим также для поддержания нормального циклоза в растительных клетках.

Кальций участвует в регуляции клеточного метаболизма посредством локального изменения концентрации его свободных ионов в цитоплазме.Концентрация свободного кальция в цитозоле растительных и животных клеток низка - 10~8~10"7 М, тогда как концентрация общего содержания кальция в растительной клетке составляет 2■ 10"2 М.

Поступление кальция в клетки животных обеспечивается работой нескольких механизмов. Показано, что кальций поступает в цитоплазму извне через специальные каналы в плазматической мембране по 1радиен- ту электрохимического потенциала. В возбудимых клетках имеются потен циалзависимые каналы, которые открываются при деполяризации мембраны. Каналы другого типа - рецепторзависимые - активируются при связывании гормонов с рецепторами. Оба типа каналов сходны по ряду свойств: блокируются ионами а в отсутствие Са2+ во внешней среде проницаемы для Na+. В ЭПР также имеются кальциевые каналы, сходные с каналами плазматических мембран, причем электрохимический традиент движет их в цитозоль.

Кальциевые каналы обнаружены и в мембранах растительных клеток. Показана регуляция входа 45Са2+ микросомы, выделенные из колеоп- тилей кукурузы и гипокотилей тыквы, светом, ИУК и зависимость этой реакции от кальмодулина. Для функционирования потенциалзависимых Са2+-каналов (харовая водоросль Nitellopsis) необходимо наличие Mg2+ Состояние этих потенциалзависимых каналов контролируется системой ферментов, ре1улируюгцих уровень цАМФ в клетке. Были также получены данные, свидетельствующие о прямом действии экзогенного цАМФ на поглощение 45Са2+ в клетках Chlamydomonas reinchardii (мутант без клеточной стенки). Большое значение имеют системы удаления Са2+ из цитозоля, так как ионы кальция в больших концентрациях вредны клетке.

Для связывания Са2+ многие белки имеют в своей структуре универсальные специфические места. Наиболее широко распространенные это EF-hand мотив и С2 домен. EF-hand мотив встречается в паре, где единичный мотив связывает один Са2+. Однако константы диссоциации Са2+ различны и зависят от самого белка (10-7 и 10-5М для EF-hand) и (10-6-10-3М) для С2 домена. Около 100 известных белков обладают С2 доменом. С2 домен и EF-hand не единственные места связывания Са2+. Например, аннексин - фосфолипид-связывающий белок на внутренней поверхности плазматической мембраны и связан с цитоскелетом. Са2+ каналы и Са2+АТРазы также имеют места связывания Са2+, отличные от С2 и EF-hand. Кальмодулин обнаружен почти во всех клетках животных и растений. Типичная животная клетка содержит более 107 молекул КМ, что соответствует почти 1% всего клеточного белка. КМ функционирует как многоцелевой внутриклеточный рецептор для Са2+, участвующий в большинстве процессов, регулируемых этими ионами. Взаимодействуя с КМ, Ca2+ может изменять активность около 100 ферментов. Среди ферментов контролируемых КМ можно выделить семейство Са2+КМ- зависимых киназ. Фосфорилаза-киназа легких цепей миозина, которая активирует сокращение гладких мышц и СаМ-киназа I, СаМ-киназа II, СаМ-киназа III, СаМ-киназа IV. Все они взаимодействуют с КМ преобразуя Са2+ сигнал в сигнал фосфорилирования.

Тропонин С является изоформой КМ. Он присутствует в поперечно-полосатых мышцах, где регулирует взаимодействие между актином и миозином. Подобно КМ он имеет две пары Са2+- связывающих EF-hands, локализованных на противоположных концах пептидной цепи. Сродство этих участков к Са2+лежит в области 10-5 и 10-7М.

Белок кальсеквестрин (2 кД) и другой Са2+-связывающий белок с высоким сродством к Са2+ (55 кД) локализуются во внутреннем объеме СР. Предполагают, что кальсеквестрин внутри терминальных цистерн СР связывает большую часть Са2+, поступающего в них при работе Са2+-АТРазы. Кальсеквестрин не только служит буфером для Са2+ внутри терминальных цистерн, но и концентрирует Са2+ около Са2+-каналов, увеличивая тем самым скорость освобождения Са2+. Аналогичную буферную роль в ЭР немышечных клеток играет Са2+- связывающий белок - кальрегулин или кальретикулин

 

120. Основные сайты (места) биосинтеза АФК в растениях, локализация синтеза АФК в фотосистемах. Классический и неклассический пути синтеза гидроксильного радикала.

В основном состоянии молекулярный кислород представляет собой относительно стабильную молекулу, спонтанно не реагирующую с различными макромолекулами. Это объясняется его электронной конфигурацией: основная форма кислорода в атмосфере (3О2) находится в триплетном состоянии. Однако аэробные организмы сталкиваются с постоянной опасностью, связанной с тем, что многие процессы с участием молекулярного кислорода сопровождаются образованием так называемых активных форм кислорода, АФК, обладающих чрезвычайно высокой реакционной способностью. В настоящее время к числу АФК относят производные кислорода радикальной природы (супероксид-радикал (анион-радикал) О2•-, гидроперекисный радикал НО2•, гидроксил-радикал НО•), а также его реактивные производные (перекись водорода Н2О2, синглетный кислород 1О2 и пероксинитрит)

Синглетный кислород (1О2) образуется в хлоропластах в результате взаимодействия молекулярного кислорода с хлорофиллом, возбужденным квантом света и находящимся в триплетном состоянии. Энергия, необходимая для этого перехода, составляет примерно 22 ккал/моль. В результате поглощения избыточной энергии (что часто имеет место в реальных условиях) происходит обращение спина одного электрона и формирование синглетного кислорода Образование супероксидного анион-радикала (О2•-) происходит в фотосистеме I (ФС I) и II (ФС II) хлоропластов и на комплексах дыхательной цепи в митохондриях, а также в ряде реакций, протекающих в пероксисомах (при окислении ксантина ксантиноксидазой). В ФС I появление супероксидного радикала происходит в реакции Мёллера и связано с работой 4Fe-4S-кластеров, ферредоксина и/или ферредоксин-НАДФН-редуктазы. Около 10-25% всего нециклического электронного потока может идти на образование супероксид-радикала. Генерация анион-радикала, кроме того, возможна на уровне реакционного центра ФС II, предположительно в QА и QВ сайтах. В митохондриях образование О2•- сопряжено с функционированием дыхательной электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) во внутренней митохондриальной мембране и захватом молекулярным кислородом электронов с гемов (b1 и b2) и относительно долгоживущих семихинонов в Qin-сайте. По некоторым оценкам, даже в физиологически оптимальных условиях примерно 2-5 % проходящих по ЭТЦ электронов идут на образование супероксидных радикалов. Кроме того, в определенных условиях (например, при окислении пиридиннуклеотидов и полифенолов) при физиологическом значении рН некоторые апопластные пероксидазы, проявляя свою оксидазную функцию, способны к образованию супероксидного анион-радикала. Установлено, что пероксидаза клеточной поверхности является одним из основных источников супероксидного радикала при отсечении корней от проростков пшеницы. О2.- является источником образования других, более токсичных активных форм кислорода.

Супероксидрадикал может протонироваться до гидропероксидного радикала в результате реакции (уравнение 1): О2.- +H+ = НО2• (1)

Дисмутация двух анион-радикалов приводит к образованию перекиси водорода H2О2 (уравнение 2): 2О2•- + 2Н+ = Н2О2 + О2 (2) Дисмутация может протекать спонтанно или при участии специфических ферментов - супероксиддисмутаз (СОД). В клетках СОД представлена тремя изоформами, которые различаются входящими в состав активных центров ионами металлов: CuZn-СОД, Mn-СОД и Fe-СОД. Механизм действия СОД включает последовательное восстановление и окисление металла активного центра фермента супероксидными анион-радикалами. Перекись водорода образуется не только в результате нейтрализации супероксид-радикала при участии СОД, но и во многих других реакциях, особенно интенсивно протекающих в пероксисомах и глиоксисомах. Например, при окислении гликолата - одного из продуктов фотосинтеза, образующегося в результате оксигеназной реакции, катализируемой рибулозобисфосфаткарбоксилазой-оксигеназой (РБФКО). Гликолат транспортируется в пероксисомы и окисляется гликолатоксидазой до глиоксилата с образованием перекиси. С образованием Н2О2 в пероксисомах идут реакции при участии флавиновых дегидрогеназ (ксантиноксидаза, альдегидоксидаза и др.). Распад запасных жиров и процесс β-окисления жирных кислот, протекающие в глиоксисомах, также сопровождаются образованием Н2О2. Как и в случае супероксидного анион-радикала, пероксидазы апопласта способны генерировать перекись в процессе реализации оксидазной функции. При этом изменение рН определяет соотношение пероксидазной и оксидазной активностей пероксидаз. Так, было показано, что пероксидаза клеточной стенки, способная к образованию перекиси водорода при нейтральном рН, восстанавливала свою пероксидазную функцию при смещении рН окружающего раствора в кислую сторону.

Супероксид-радикал и перекись водорода в присутствии ионов железа (Fe2+, Fe3+) и/или меди (Cu2+) могут вступать в реакции Фентона (уравнения 3, 4) и Габера-Вайса (Haber-Weiss) (уравнение 5) и образовывать гидроксильный радикал, который является самым мощным известным окислителем:

О2•- + Fe+3 (Cu+2) = О2 + Fe+2 (Cu+) (3)

Fe+2 (Cu+) + Н2О2 = Fe+3 (Cu+2) + НО. + НО- (4)

О2•- + Н2О2 = НО. + НО- + О2 (5)

Таким образом, появление активных форм кислорода в живом организме связано с протеканием метаболических реакций в различных клеточных компартментах.

Касаясь значения гидроксильного радикала, следует отметить, что он может образовывать при радиолизе воды в реакции Хабера-Вейса, а также в реакции Фентона между ионом 2-х валентного железа и перекисного водорода:

Н2О2 + Fe2+ → Fe3+ + OH- + OH•

Радикал гидроксила чрезвычайно активен и оказывает разрушающее действие на различные молекулы. Действуя на SH-группы, гистидиновые и другие аминокислоты, остатки белков, HO• вызывает денатурацию последних, инактивирует ферменты, разрушает углеводные мостики между нуклеотидами и таким образом разрывает цепи ДНК и РНК, инициирует процессы липопероксидации, вызывает мутации и гибель клеток