Ферменти генетичної інженерії, їх властивості.

1.Задачі сучасної біотехнології. Основні етапи біотехнологічного процесу.

Сучасне визначення біотехнології – це промислове використання біологічних процесів і агентів для отримання високоефективних форм мікроорганізмів, культур клітин і тканин рослин та тварин із заданими властивостями.  

Основними задачами біотехнології можна визначити таки:

-      можливість точної діагностики, профілактики і лікування інфекційних і генетичних захворювань;

-      значне збільшення врожайності сільськогосподарських культур шляхом створення рослин стійких до шкідників, грибкових та вірусних інфекцій та шкідливого впливу навколишнього середовища;

-      створення мікроорганізмів, що продукують різні хімічні сполуки, антибіотики, полімери, амінокислоти, ферменти;

-      створення порід сільськогосподарських та інших тварин, спадкові властивості яких поліпшені;

-      переробка викидів, що забруднюють навколишнє середовище.

Промисловий біотехнологічний процес, в якому для виробництва комерційних продуктів використовують мікроорганізми, як правило складається з трьох ключових етапів:

1.    Початкова обробка: обробка сировини для використання її мікроорганізмами в якості джерела поживних речовин.

2.    Ферментація і біотрансформація: ріст мікроорганізмів у великому біореакторі (ферментація) з наступним утворенням необхідного метаболіту, наприклад, антибіотика, амінокислоти, білку (біотрансформація).

3.    Кінцева обробка: очистка необхідної речовини від компонентів культурального середовища або клітинної маси.

 

 

2. Використання досягнень біотехнології в рослинництві, тваринництві, медицині.

Біотехнологія і рослинництво. В першу чергу це захист рослин від шкідників і хвороб. Біотехнологічні шляхи захисту рослин включають:

1.    Створення нових сортів рослин, стійких до певних видів захворювань, введення безпосередньо у клітини специфічного агента, який знижує життєздатність шкідника, або синтезує речовини, які пригнічують розвиток хвороби.

2.    Введення в геном рослин генів стійкості до деяких гербіцидів, що надає можливість використання цих гербіцидів для боротьби з бур'янами безпосередньо на угіддях.

3.    Використання речовин біогенного походження, які пригнічують відкладання яєць комахами або стимулюють активність природних ворогів комах-шкідників.

4.    Використання вірусних препаратів і антибіотиків для боротьби з хворобами, кореневою гниллю.   

По друге, використання досягнень генної інженерії для створення азотфіксуючих злакових рослин.

Ще одним напрямком є біодеградація пестицидів. Оскільки дія пестицидів не є досить вибірковою, вони, крім корисного впливу, можуть наносити і шкоду сільськогосподарським культурам. Крім того, деякі пестициди зберігаються у грунті тривалий час, що також може викликати зменшення врожайності. Тому мікробна трансформація пестицидів, до якої здатна мікрофлора грунту, надає можливість вирішити цю проблему. В наш час за допомогою методів генної інженерії сконструйовані штами мікроорганізмів із збільшеною ефективністю біодеградації.

Біотехнологія дозволяє вирішити ще одну проблему рослинництва – це створення біологічних добрів. Вони використовуються для збагачення грунту зв’язаним азотом, вітамінами і фітогормонами, а також перетворюють складні сполуки фосфору в прості, які легко засвоюються рослинами, 

Біотехнологія і тваринництво. У галузі тваринництва біотехнологічні дослідження здійснюються в декількох напрямах.

По-перше, це профілактика інфекційних захворювань сільськогосподарських тварин за допомогою рекомбінантних живих вакцин і генно-інженерних вакцин-антигенів, а також рання діагностика цих захворювань з використанням моноклональних антитіл.

По друге, це вирішення проблеми повноцінної годівлі тварин за рахунок добавки до раціонів білка одноклітинних, збагачення рослинних кормів мікробним білком, мікробіальне отримання незамінних амінокислот та ін..     

По трете, застосування генно-інженерних гормональних препаратів, що покращують ріст тварин. До цих речовин належать: гормон росту – соматотропін, релізінг-фактори, що регулюють синтез соматотропіну, соматомедін, інсулін, тіреотропін та ін.. Застосовуються препарати як у вигляді щоденних ін’єкції, так і у вигляді аплікацій, які сприяють створенню депо тривалої дії препарату.

Четвертим напрямом використання досягнень біотехнології у тваринництві є створення трансгенних тварин, тобто тварин, в геномі яких відбулися зміни на рівні одного або декількох генів. Трансгенні тварини набувають нові властивості, це може бути збільшення інтенсивності росту за рахунок введення додаткового гену гормону росту, підвищення стійкості до певних захворювань, отримання продукції, наприклад, молока з новими якостями: із зменшеним вмістом жиру і підвищеною кількістю білку, із зниженою концентрацією лактози. А також з вмістом речовин, що в звичайних умовах ніколи не синтезуються у молоці, таких як фактори зсідання крові, якими лікують людей хворих на гемофілію.  

Ембріоінженерія – напрямок біотехнології, якому в останні часи приділяють найбільшу увагу. Ембріоінженерія включає трансплантацію ембріонів, за допомогою якої збільшується кількість нащадків, що отримують від видатних тварин; міжвидові пересадки ембріонів і створення химерних тварин, що набувають властивості не двох, а чотирьох і більш батьків; отримання однояйцевих близнюків; клонування тварин шляхом пересадки ядер ембріональних клітин в енуклейовані яйцеклітини та ін. Всі ці дослідження дозволяють збільшити продуктивність сільськогосподарських тварин і покращити їх властивості.

Біотехнологія і медицина. За допомогою біотехнології для потреб медицини виробляються наступні препарати:

-      антибіотики – специфічні продукти життєдіяльності, що володіють високою фізіологічною активністю по відношенню до певних груп мікроорганізмів і до злоякісних пухлин, вибірково затримують їх ріст, або повністю пригнічують розвиток. Постійний розшук нових антибіотиків пов’язаний з токсичністю існуючих препаратів; алергічними реакціями, що викликаються їх використанням; зростанням стійкості патогенних мікроорганізмів до препаратів, що застосовуються;

-      гормони, які використовують з метою лікування таких хвороб, як карликовість (гормон росту соматотропін), цукровий діабет (інсулін), безпліддя (фолікулостимулюючий і лютенізуючий гормони), олігопептидні гормони нервової системи, які знімають больові відчуття, підвищують працездатність, концентрують увагу, покращують пам’ять, стероїдні гормони наднирників (кортизон) для лікування ревматоїдних артритів.

-      інтерферони і інтерлейкіни – речовини, які виділяються клітинами людини і тварин у відповідь на інфікування вірусами;

-      фактори зсідання крові, особливо фактор VІІІ (отримують за допомогою культивування клітин ссавців) і фактор ІХ (отримують генно-інженерним шляхом з використання штаму Е.соІі), необхідні для терапії форм гемофілії – спадкової хвороби, при якій кров втрачає здатність зсідатися;

-      моноклональні антитіла – продукти В-гібридомних клітин – використовують для діагностики різноманітних хвороб. Завдяки високій специфічності вони забезпечують ідентифікацію не лише виду збудника, а і його серотипу. Вони дозволяють діагностувати вагітність, виявляти схильність до діабету, ідентифікувати спадкові хвороби, їх використовують для діагностики раку і визначення його форм. Крім того, моноклональні антитіла мають і лікувальне значення, в першу чергу для лікування раку. Моноклональні антитіла зв’язують з токсичними для ракових клітин сполуками і, завдяки їх високої специфічності, вони доставляють отруту точно за адресою, не викликають руйнування і пошкодження здорових клітин;

-      рекомбінантні вакцини і вакцини-антигени. Вакцинація – один з способів боротьби з інфекційними захворюваннями. Для отримання рекомбінантних вакцин звичайно використовують вірус коров’ячої віспи (вірус вісповакцини ВВВ). В його ДНК вбудовують чужорідні гени, що кодують імуногенні білки різних збудників (вірусу грипу, герпесу, гепатиту В, ін..) і отримують вакцини проти певних інфекцій. Вакцини-антигени зтворюють шляхом клонування генів збуднику хвороби у Е.соІі, дріжджах, клітинах комах і тварин;

-      ферменти медичного призначення. Різноманітне використання ферментних препаратів у медицині. Їх застосовують для розчинення тромбів, лікування спадкових хвороб, видалення нежиттєздатних, денатурованих структур, клітинних і тканинних фрагментів, звільнення організму від токсичних речовин. В сучасній медицині відомо, що протеїнази розщеплюють денатурований білок і сприяють очищенню ран і таким чином, їх заживанню. В якості носіїв для іммобілізації протеолітичних ферментів використовують волоконні матеріали на основі целюлози, полівінілового спирту, поліамідне і колагенове волокно. Готують нитки, в які при формуванні включають фермент, і використовують їх в якості шовного матеріалу. Аналіз свідчить, що використання цих препаратів в двічі прискорює процес заживання ран. Іммобілізовані протеолітичні ферменти з великим успіхом застосовують при лікуванні гнійних захворювань легень і плеври, трофічних виразок, променевих виразок шкіри.

 

 

3.Реалізація генетичної інформації прокаріот, модель оперона, конститутивні мутанти.

З молекулярної точки зору ген складається з регулюючих і структурних елементів. Регулюючі – відповідають за порядок зчитування інформації, а структурні – за структуру білку (кінцевого продукту). У прокаріот структурний ген – це безперервна ділянка молекули ДНК. Транскрипція починається після зв’язування РНК-полімерази з регулюючою ділянкою, а потім відбувається копіювання з першого гену до останнього, з утворення мРНК.

Первинна структура білку, що синтезується, визначається тільки інформацією, що існує в мРНК. Інші типи РНК, рибосоми, ферменти лише беруть участь в реалізації цієї інформації.

Було встановлено, що дія генів підлягає генетичному контролю. Сукупність суміжних структурних генів поряд з групою регуляторних генів складає одиницю генетичної регуляції – оперон. Відповідно моделі оперона хромосома містить як найменш 4 компоненти регулювання: структурний ген (або гени, що контролюють взаємозв’язані біохімічні функції S1, S2 ,S3), ген-регулятор ( R), ген-оператор (O), ген-промотор (P) (рис.4). Ген-регулятор визначає структуру білку репресору. Білок-репресор здатний зв’язуватися з геном-оператором (О), в цьому випадку процес зчитування інформації припиняється, оскільки РНК-полімераза не може пересуватися уздовж молекули ДНК. Ген-оператор (О) відповідає за порядок зчитування інформації, ген-промотор (Р) є початковою ділянкою для зв’язування РНК-полімерази, ферменту, який каталізує транскрипцію ДНК в мРНК.

Якщо у середовище додати речовину-індуктор (Y), то білок репресор блокується, втрачає здатність з'єднуватися з геном-оператором і процес транскрипції здійснюється.

В тому випадку, коли необхідно, щоб експресія відбувалась постійно, проводять мутації в гені-регуляторі, тоді змінюється структура білку-репресору і він втрачає здатність зв’язуватися з геном-оператором, або мутацію здійснюють у гені-операторі, тоді білок-репресор не розпізнає його і зв’язок також не відбувається. Такі мутанти мають назву конститутівні мутанти. 

В ДНК Е.соІі гени, що кодують ферменти біосинтезу деяких амінокислот, знаходяться у різних ділянках хромосоми, але усі вони контролюються одним тим самим регуляторним геном - регулоном . Іншій приклад регулону – це сукупність генів, що кодують близько двох десятків білків і ферментів, які створюються у клітині у відповідь на пошкодження ДНК – це так званий SOS-регулон.

Оперони і регулони, які контролюють подібні фізіологічні функції відкриті майже у всіх видах бактерій.

 

 

4. Реалізація генетичної інформації еукаріот, ділянки, що забезпечують регулювання роботи генів (аутенуатори, енхансери, ТАТА-бокс, ГЦ-бокс).

У еукаріот значна кількість структурних генів складається з декількох дискретних кодуючих ділянок – екзонів, відділених некодуючими ділянками – інтронами. Транскрипція генів у еукаріот відбувається в ядрі клітини, що сприяє утворенню мРНК-попередників, тобто про-мРНК, або гетерогенних ядерних мРНК.

Після завершення транскрипції структурного гену еукаріот інтрони вирізуються (процесинг) з первинного транскрипту, а екзони зшиваються один з одним (сплайсінг) з утворенням функціональної, або зрілої мРНК. Після закінчення сплайсінгу зріла мРНК, яка має значно менший розмір, ніж ядерна мРНК, надходить в цитоплазму клітини, де відбувається друга, заключна, стадія експресії гену – трансляція білку.

На відміну від генів прокаріот, гени, що кодують білки еукаріот, не поєднані в оперони. Кожен еукаріотичний структурний ген має свій власний набір регуляторних елементів, як ті з яких починається процес зчитування інформації (промоторні), так і ті, завдяки яких синтез припиняється – термінатори транскрипції, або термінуси.

За сучасними уявленнями, на початку гену еукаріот існують ділянки, що забезпечують регулювання роботи генів і здійснюють первинний контакт і точну орієнтацію РНК-полімерази відносно нуклеотиду, з якого відбувається транскрипція. Ці ділянки позначають як ГЦ і ТАТА-бокс, залежно від нуклеотидів, які входять до їх складу. Ділянка ГЦ-бокс розташована на відстані біля 90 нуклеотидів від сайта ініціації транскрипції і виконує функцію початкового контакту РНК-полімерази з промотором. Це специфічна група, тобто характерна для певного гену. Друга група – ТАТА-бокс, визначається, як неспецифічна, вона віддалена від сайту ініціації на 25-30 п.н. і на відміну від ділянки ГЦ, має закономірну послідовність нуклеотидів і завжди починається з чергування тиміну (Т) і аденіну (А). Ця група забезпечує правильний початок транскрипції за рахунок того, що РНК-полімераза – фермент транскрипції, який складається з двох частин: 1 –розпізнавальної, 2 – активної, зв’язується з ТАТА-бокс ДНК розпізнавальною частиною, а активна частина розміщується безпосередньо над першим нуклеотидом, який транскрибується. Механізм ТАТА-бокс однаковий для всіх генів.

За специфічну регуляцію включення генів у еукаріот відповідають специфічні локуси (ділянки) – енхансери (посилювачи). Їх функції полягають в активації гену, інтенсифікації його транскрипції за рахунок збільшення кількості з’єднань РНК-полімерази з промотором. Кожне з’єднання ферменту з промотором викликає процес транскрипції, тобто відбувається експресія гену і збільшується кількість кінцевого продукту. Властивості енхансеру виявляються лише при наявності певних регуляторних білків, що здатні розпізнавати енхансери власних генів, приєднатися до них і таким чином викликати активацію генів.

Необхідно відмітити, що як в ділянках, що термінують транскрипцію генів, так і між промотором і першим структурним геном виявлені ділянки, які здатні блокувати транскрипцію. В певних умовах відбувається утворення сигналу, що уповільнює процес транскрипції - це явище атенуації, а ділянка ДНК, активація якої викликає припинення експресії, має назву атенуатор.    

В структурі ДНК еукаріот відкрити спейсери - міжгенні ділянки, які необхідні для організації структури генома і регуляції функції окремих ділянок ДНК. В генетичної інженерії ці ділянки можна використовувати для внесення чужорідних генів. Відкриття спейсерів дозволяє визначити ген, як ділянку ДНК, що обмежена двома кінцевими спейсерами.

 

     

5. Види точкових мутацій, мутації типу зсуву рамки зчитування, генетичні наслідки точкових мутацій.

У тому випадку, коли під дією мутації змінюється лише один нуклеотид, говорять про точкові мутації. Оскільки до складу ДНК входять азотисті основи тільки двох типів – пурини й піримідини, всі точкові мутації із заміною основ поділяють на два класи: транзиції (заміна пурину на пурин або піримідину на піримідин) і трансверсії (заміна пурину на піримідин або навпаки). Завдяки виродженості генетичного коду існує три генетичних наслідки точкових мутацій: збереження смислу кодона (синонімічна заміна нуклеотиду, тобто нейтральна мутація), зміна смислу кодона, що приводить до заміни амінокислоти у відповідному місці поліпептидного ланцюга (міссенс-мутація) або утворення безглуздого кодона з передчасною термінацією (нонсенс-мутація). У генетичному коді є три безглуздих кодони: амбер – UAG, охр – UAA і опал – UGA. Відповідно до цього отримують назву й мутації, що приводять до утворення безглуздих триплетів (наприклад амбер-мутація).

За впливом на експресію генів мутації розділяють на дві категорії: мутації типу замін пар основ і типу зсуву рамки зчитування (frameshift). Останні являють собою делеції або вставки нуклеотидів, число яких не кратне трьом, що пов'язане із триплетністю генетичного коду.

 

 

Ферменти генетичної інженерії, їх властивості.

У генетичній інженерії використовують ферменти, які отримані з бактерій або клітин тварин, що культивуються in vitro і заражених вірусами. Ці ферменти дозволяють проводити різні маніпуляції з молекулами ДНК: розрізати у певних місцях, з’єднувати різні за походженням фрагменти, синтезувати нові послідовності, які не існують у природі та ін.. До основних ферментів генної інженерії належать: ДНК-полімерази, РНК-полімерази, лігази, нуклеази, рестриктази і зворотна транскриптаза, або ревертаза.

ДНК-полімерази. В основі реплікації ДНК (створення копії, самоподвоєння) лежить принцип компліментарності - спарування певних нуклеотидних основ (гуанін до цитозіну, аденін до тиміну) і матричний спосіб синтезу дочірної ДНК. Реплікація починається з певної ділянки дволанцюгової молекули ДНК (реплікаційної вилки) і здійснюється одночасно у двох ланцюгах, які поступово роз’єднуються. Дочірній ланцюг синтезується на основі ферментів – ДНК-полімераз.

У клітинах кишкової палички Е.соІі знайдено три різних ДНК-полімерази, які розрізняються за швидкістю каталізу реакції синтезу нових ланцюгів ДНК, а також за нуклеазною активністю.

Швидкість реплікації в хромосомах прокаріот складає 1000 нуклеотидів за секунду, а для еукаріот – біля 100 нуклеотидів.

ДНК-полімераза І – не є основним ферментом реплікації, але вона володіє функцією корекції, оскільки вилучає нуклеотиди, які були включені у ланцюг помилково. Функції ДНК-полімерази ІІ ще не з’ясовані. Активність цього ферменту низька і складає лише 5% активності ДНК-полімерази І.

Головним білком при синтезі і реплікації нового ланцюгу ДНК хромосоми є ДНК-полімераза ІІІ, яка служить дійсним ферментом реплікації хромосом. Молекули цього ферменту полімеризують біля 15 000 нуклеотидів за хвилину при 37 ?С.

РНК-полімерази. Незважаючи на високу ферментативну активність ДНК-полімераз, вони не здатні ініціювати синтез дочірніх полінуклеотидних ланцюгів. Цю роль виконують РНК-полімерази. Фермент РНК-полімераза знаходить промотори, активує матрицю ДНК і відбувається локальне розплітання подвійної спіралі ДНК. Однак, основна роль РНК-полімераз полягає у каталізі процесу транскрипції (тобто створенні РНК на підставі ланцюгу ДНК). У прокаріот процес транскрипції каталізує одна РНК-полімераза, а у еукаріот – три: РНК-полімераза І бере участь у біосинтезі високомолекулярних рибосомних РНК, РНК-полімераза ІІ – в процесі транскрипції генів, що кодують білки, а РНК-полімераза ІІІ – у синтезі низькомолекулярних РНК.

     Лігази - це ферменти, які здатні лігірувати (зшивати, з’єднувати) між собою різні фрагменти ДНК.

У клітинах лігази беруть участь як в процесах синтезу ДНК, так і при її репарації, тобто відновленні нормальної структури ДНК після часткового пошкодження генетичного апарата. В наш час відоме, що не завжди пошкоджені структури ДНК перетворюються на мутантів. Багато цих структур, особливо в тому випадку коли дія фактору пошкодження була слабкою, відновлюються за допомогою специфічних факторів, що здійснюють репарацію, в тому числі і за допомогою лігаз. Найчастіше для лігірування у генної інженерії використовують лігазу фага Т4. За допомогою лігази Т4 з’єднуються будь-які фрагменти ДНК з будь-якми кінцями: „липкими” або „тупими”. 

Рестриктази це група ферментів, які розрізають дволанцюгову молекулу ДНК. Назва рестриктаз складається з начальних букв латинської назви виду бактерій, з якого був виділений фрагмент, і додаткового позначення, оскільки з бактерій одного виду може бути виділено декілька різних рестриктаз. Залежно від характеру розрізання рестриктази поділяються на дві групи. Рестриктази І типу розрізають молекулу ДНК в будь-якому місті і не мають певного сайту узнавання, або сайту рестрикції (специфічна послідовність нуклеотидів, в якій здійснюється розрізання ланцюгу). Ці рестриктази не можливо використовувати для рішення задач генної інженерії.

Рестриктази ІІ типу мають певні сайти рестрикції, розпізнають певну послідовність нуклеотидів і гідролізують ланцюг усередині сайту. Сайти рестрикції рестриктаз ІІ типу наведені симетричними при повороті на 180? послідовностями - поліндромами :

 Рестриктази ІІ типу поділяються на декілька класів залежно від розміру сайту рестрикції і довжини отриманих фрагментів:

1 – дрібнорозрізаючи - сайт рестрикції складається з 4 пар нуклеотидів (п.н.)

2 – середньорозрізаючи – сайт рестрикції – 6-8 п.н.

3 – крупнорозрізаючи – сайт рестрикції – 10-14 п.н. 

 

Рестриктази ІІ типу можна поділити на дві групи залежно від того, як вони розщеплюють послідовність ДНК. Одні вносять розрив по осі симетрії послідовності, яку розпізнають, а інші – зі зсувом, з утворенням „сходинки”. В першому випадку створюються так звані „тупі кінці”:

В другому випадку створюються фрагменти з „ліпкими” кінцями:

Фрагменти ДНК, що мають однакові „ліпкі” кінці, можуть з’єднуватися один з одним за допомогою лігази, при цьому сайт рестрикції відновлюється. Фрагменти з „тупими” кінцями можуть бути з’єднані незалежно від того, якої рестриктазою вони були створені. Фрагменти з „ліпкими” кінцями більш сприятливі для створення рекомбінантних ДНК, оскільки лігаза забезпечує з’єднання фрагментів без перешкод. 

Зворотна транскриптаза (ревертаза). Під час досліджень інфекційних часточок вірусу саркоми Рауса було встановлено, що в них міститься фермент, аналогічний ДНК-полімеразі, але синтезуючий ДНК не на підставі ланцюгу ДНК, а на ланцюгу РНК. В цьому випадку інформація передається у зворотному напрямку, тобто від РНК до ДНК.

Біологічна роль ревертази полягає в синтезі копій ДНК з геномів РНК у деяких РНК- вмістних вірусів. Віруси, спадкова інформація в яких закодована в РНК а не в ДНК, мають назву ретровіруси. Зворотна транскриптаза в ретровірусах здатна синтезувати по матриці РНК комплементарний до неї ланцюг ДНК, руйнувати саму РНК, а потім на підставі матриці ДНК синтезувати аналогічний вірусної РНК комплементарний ланцюг ДНК. Після цього здійснюється експресія гену, тобто транскрипція з ДНК на РНК і трансляція, під час якої створюються вірусні білки.

Необхідно підкреслити, що процеси, які відбуваються у ретровірусах, не суперечать головній догмі молекулярної генетиці, яка полягає в тому, що принципова схема передачі генетичної інформації здійснюється шляхом ДНК > РНК > білок, оскільки початкова РНК руйнується, а створення вірусних білків відповідає головної догмі.