Способи дозрівання ооцитів in vitro, капацитація сперматозоїдів.

Дозрівання ооцитов in vitro.

Хоча більшість ооцитів, витягнутих з фолікулів яєчників, відновляють мейоз і досягають метафази II, їх запліднення часто не забезпечує повноцінного розвитку зародків. Припускають, що основною причиною цього є неповноцінне дозрівання ооцитів.

Однією з причин може бути те, що при дозріванні ооциту in vitro у цитоплазмі не виробляється в достатній мірі фактор, що контролює формування і розвиток чоловічого пронуклеуса. Вважають, що для появи в цитоплазмі ооциту фактора, що викликає дозрівання чоловічого пронуклеуса, необхідно забезпечити індуктивний вплив нормального оточення ооциту у фолікулі протягом не менш 6 год. після початку мейотичного дозрівання.

Це було підтверджено в дослідах по заплідненню in vitro ооцитів свиней, вилучених з фолікулів на різних стадіях мейозу. Встановлено, що стероїдні гормони не потрібні для запуску мейозу у ссавців, але необхідні для повного фізіологічного дозрівання ооциту.

У зв'язку з тим, що стероїдні гормони й інші фактори, що виробляються фолікулярними клітинами, впливають на дозрівання ооцитів, було зроблене припущення, що культивування ооцитів з фолікулярними клітинами може підвищити їх здатність до нормального запліднення і наступного ембріонального розвитку. Багато явищ всередині фолікула, включаючи біосинтез стероїдів і синтез білків, регулюють гонадотропні гормони. Тому при культивуванні ооцитів всередині фолікулів або з фолікулярними клітинами гонадотропини повинні бути обов'язковою складовою частиною середовища.

Необхідність прямого контакту між соматичними (фолікулярними) клітками і статевими клітинами обумовлена цілим рядом причин. Фолікулярні клітини відіграють важливу роль у живленні ооциту. Вони забезпечують енергетичний субстрат ооциту, беруть участь у переносі деяких попередників амінокислот, нуклеотидів і фосфоліпідів в ооцит, генерують інструктивні сигнали, що впливають на ядро і прямий синтез визначених структурних білків. Інструктивні сигнали, які необхідні для дозрівання ооцитів, найбільш важливі в перші 6—8 год. після ініціації.

Незважаючи на низький вихід ооцитів, при кожному витягу, можливість багаторазового використання тварини, з урахуванням інформації про походження отриманих ооцитів, відкриває нові перспективи застосування методу запліднення in vitro у практичних цілях.

Капацитація сперматозоїдів. Важливим етапом у розробці методу запліднення ссавців було відкриття явища капацитації сперміїв. У 1951 р. М.К.Чанг і одночасно з ним Г.Р.Аустин встановили, що запліднення у ссавців настає тільки в тому випадку, якщо спермії протягом декількох годин до овуляції знаходяться в яйцепроводі тварини. Ґрунтуючись на спостереженнях по вивченню проникнення сперміїв в яйцеклітини пацюка в різний термін після спарювання Аустин ввів термін капацитація. Він означає, що в спермії повинні відбутися деякі фізіологічні зміни до того, як сперматозоїд придбає здатність до запліднення.

Капацитація включає початкову зміну мембрани спермія, що дозволяє йому пройти другу фазу (акросомную реакцію). В даний час першу фазу позначають як власне капацитацію, а другу — як акросомную реакцію.

Розроблено кілька методів капацитації еякуйованих сперміїв домашніх тварин. Для видалення білків з поверхні сперміїв, які, очевидно, гальмують капацитацію сперміїв, було використане середовище з високою іонною силою.

На підставі дослідів по заплідненню in vitro вважають, що найбільш ефективним способом видалення сім’яної плазми і розріджувача сперми у бугаїв є центрифугування, режими якого можуть бути різними. Для звільнення від плазми і розріджувача також застосовують метод swim-up, що складається у спливанні сперміїв з активним поступальним рухом із дна пробірки в поверхневий шар чистого середовища, це дозволяє відбирати найбільш життєздатні гамети. Іншим ефективним методом відбору сперміїв бугаїв з високою рухливістю для запліднення in vitro є їх розподіл по градієнтах концентрації у перколі.

Іонофор А23187 є ефективним індуктором капацитації й акросомної реакції сперматозоїдів ссавців. У концентрації 0,1 мкм і більш він різко підсилює проникність мембран сперміїв для іонів кальцію, що супроводжується швидкою втратою рухливості сперміїв. Однак внесення в середовище БСА (сироватковий альбумін бугаїців) чоловічих гамет одразу після обробки іонофором сприяє збереженню їхньої рухливості, імовірно, внаслідок припинення надходження великої кількості іонів кальцію в цитоплазму спермія і видалення його надлишків. У плазматичній же мембрані при цьому залишається достатня кількість іонофору для надходження необхідних доз іонів кальцію в цитоплазму спермія і, таким чином, для індукції кальцій-залежної акросомної реакції сперміїв.

Ефективним способом прискорення капацитації сперміїв бугаїв є їх обробка розчином з високою іонною силою (380-390 мОсм/кг), що характеризується підвищеною концентрацією хлориду натрію. Після обробки сперміїв середовищем з високою іонною силою їх відмивають від цього середовища центрифугуванням і інкубують протягом деякого часу в ізотонічному середовищі для «докапацитації».

Капацитацію сперміїв бугаїв можна індукувати за допомогою фолікулярної рідини корови, теплова обробка фолікулярною рідиною при 56°С дозволяє запобігти згортанню її білків і, також, уникнути злипання чоловічих гамет.

Відомо, що рідина яйцепроводів корів і теличок, що знаходяться в стані охоти, викликає капацитацію сперміїв бугаїв. Запліднення in vitro дозрілих поза організмом ооцитів корів сперміями бугая, преінкубованими в середовищі з 25% еструсної рідини яйцепроводів теличок, привело до пенетрації (проникнення) 70% ооцитів, тоді як у контролі (преінкубація сперміїв у середовищі без рідини яйцепроводів) була отримана пенетрація лише 1% ооцитів.

На ефективність капацитації сперміїв і запліднення яйцеклітин in vitro впливає також рН середовища. У свиней і овець зареєстрований найвищий відсоток пенетрації при капацитації сперміїв кнурів у середовищі з рН 7,8 з наступним заплідненням ооцитів у середовищі з рН 7,4. Для великої рогатої худоби — навпаки, рН середовища 7,4 є оптимальним для капацитації сперміїв, а рН 7,8 — для запліднення ооцитів.

Важливим фактором, що впливає на запліднення in vitro дозрілих поза організмом яйцеклітин корів, є температура спільної інкубації чоловічих і жіночих гамет. Відзначено, що ефективність запліднення залежить від температури дозрівання ооцитів — частіше запліднювалися ооцити, що дозріли in vitro при 39°С, чим ооцити, що дозріли при більш низьких температурах.

Однак найбільше визнання одержав спосіб капацитації сперміїв з використанням гепарину. Пайєти з замороженою спермою бугая відтають у водяній бані при 39°С протягом 30—40 с. Після 15 хв інкубації з гепарином (200 мкг/мол) суспензію розріджують до концентрації 50 мільйонів сперміїв у молі.

Використовуючи прийом багаторазової зміни середовища, можна в кілька разів збільшити ефективність використання однієї порції еякуляту, що особливо важливо при застосуванні сперми від високоцінних бугаїв-плідників.

42.Методи запліднення яйцеклітин ссавців in vitro.

Запліднення in vitro. Запліднення яйцеклітин у ссавців здійснюється в яйцепроводах. Це ускладнює доступ дослідника до вивчення умов середовища, у якому відбувається процес запліднення. Тому система запліднення in vitro була б цінним аналітичним інструментом для вивчення біохімічних і фізіологічних факторів, що включаються в процес успішного з'єднання гамет.

Пенетрація яйцеклітин може бути полегшена ін'єкцією в них сперміїв за допомогою заточеної мікропіпетки. Як показали експерименти на кроликах, такі яйцеклітини можуть нормально розвиватися in vitro до стадії бластоцисти, а пересаджування їх реципієнтам приводить до народження нащадків. Основною проблемою при цьому є загибель багатьох яйцеклітин через ушкодження в процесі мікроін'єкції. Однак цей спосіб запліднення жіночих гамет, при якому капацитація й акросомна реакція сперміїв не є необхідними, має ту перевагу, що дозволяє використовувати для запліднення не тільки нормальні, але і нерухливі, мертві, дефектні спермії або їх голівки.

Є також методи мікроманіпуляцій з дозрілими ооцитами тварин, які засновані на порушенні цілісності їх прозорої оболонки з наступним перенесенням жіночих гамет у суспензію капацитованих сперміїв. Вони полягають в проколюванні (або просвердлюванні) прозорої оболонки або її механічному «частковому розсіченні» (partial zona dissection — PZD). Проколювання оболонки здійснюють за допомогою мікроголки, просвердлювання - під впливом кислого розчину (наприклад, розчину Тироде, рН 2-3), що виділяється з кінчика мікропіпетки.

Проколювання прозорої оболонки ооцитів миші, що овульовали, дозволяє перебороти in vitro нездатність сперміїв мишей деяких генотипів до запліднення.

Метод часткового розсічення прозорої оболонки (ЧРО) ооцитів може бути використаний для подолання незапліднюваності яйцеклітин.

Так, в результаті розсічення мікроголкою невеликої ділянки прозорої болонки зрілих ооцитів одноденного віку людини, що не запліднилися при першому заплідненні in vitro, біля половини яйцеклітин (45%) формували чоловічий і жіночий пронуклеуси після повторного запліднення, але при цьому 23% зигот були поліспермними. Кількість партеногенетичних яйцеклітин, що розвивалися, була незначною — 3,4%.