Методи введення трансгену у геном тварини: використання ретровірусних векторів, метод мікроін'єкцій ДНК, основні його етапи.

Існує декілька методів за допомогою яких трансген вводять у геном тварини.

Використання ретровірусних векторів. Перевага цього методу полягає в його ефективності і відносній простоті виконання. Використання ретровірусів дозволяє вбудовувати в РНК фага зрілу мРНК трансгену без створення на її основі ДНК. Літичний цикл розвитку фага дає можливість отримувати одразу до 100 копій вектору. Однак, існують і певні недоліки при використанні цього методу. Розмір трансгену не повинен перебільшувати 8 т.п.н., а це, у власну чергу, може позбавити його регуляторних послідовностей, які необхідні для експресії. Крім того, незважаючи на те, що ретровірусні вектори створюють так, щоб вони були не здатні до реплікації, може виникнути імовірність подвоєння вірусу в організмі тварини, що заборонено, у випадку використання тварини для їжі, або отримання комерційного продукту.    

Метод мікроін’єкції ДНК. Отримання трансгенних тварин шляхом мікроін’єкцій гену включає вилучення ембріонів на стадії пронуклеуса хірургічним шляхом або після забою донорів. Для отримання запліднених яйцеклітин, необхідних для мікроін’єкції, у тварин гормональної обробкою викликають суперовуляцію за схемою визначеною для кожного типу тварин, а потім вилучають яйцеклітини при промиванні яйцепроводів. Для ін’єкції ембріони за необхідністю, завдяки зниженому тиску, фіксують на столі мікроскопа за допомогою фіксуючої піпетки так, щоб пронуклеус, в який проводять ін’єкцію, було добре бачити. Для ін’єкції піпетку через прозору оболонку і клітинну мембрану вводять у пронуклеус, після чого додають в нього 1-2 пкл розчину ДНК. Про точність операції свідчить набухання пронуклеусу. Лише візуальне збільшення об’єму ядра вказує, що розчин ДНК дійсно потрапив у пронуклеус. Після ін’єкції ембріони звільняють від фіксуючої піпетки і культивують до часу пересадки реципієнтам. 

Необхідно відмітити, що у заплідненій яйцеклітині кроля і миші пронуклеуси видно добре, а в ембріонах сільськогосподарських тварин в цитоплазмі містяться темні ліпідовмісні гранули, які ускладнюють спостереження пронуклеусів. При центрифугуванні при 15000 g протягом 3-5 хв. гранули переходять до одного полюсу, а пронуклеуси що містяться біля центру яйцеклітини, стають видимими і доступними для ін’єкцій.

Після декількох годин культивування in vitro ембріони трансплантують в яйцепровід синхронізованих реципієнтів. Кожному реципієнту миші, кроля і свині пересаджують по 20-30 ін’єктованих зигот, причому у свиней всі ембріони трансплантують в один яйцепровід, а у мишей і кролів – окремо по яйцепроводам. У овець, кіз і великої рогатої худоби кожному реципієнту пересаджують два-чотирі ембріони.

23. Методи введення трансгену у геном тварин: використання модифікованих ембріональних стовбурових клітин, генетичний нокаут.

Використання модифікованих ембріональних стволових клітин. Клітини, що отримані з ембріонів на стадії бластоцисти, можуть проліферирувати (рости і розвиватися) в культурі, зберігаючи здатність до диференціації в будь-які типи клітин, в тому числі і в клітини зародкової лінії, при введенні в інший ембріон на стадії бластоцисти. Такі клітини називають тотипотентними ембріональними стволовими клітинами (ES). Тотипотентність – здатність створювати цілий організм з однієй клітини. ES-клітини в культурі легко модифікувати методами генної інженерії без руйнування їх тотипотентності. Наприклад, в певний сайт неістотного гену в їх геномі можна вбудовувати функціональний трансген. Потім можна відібрати клітини, що змінилися, культивувати їх і використовувати для отримання трансгенних тварин. Це дозволяє запобігти випадкового вторгнення, що властиве методу мікроін’єкцій.

В специфічний хромосомний сайт ES-клітин можна не лише вбудовувати трансген, який кодує нову функцію, але ї спрямовано руйнувати цей сайт за рахунок інтеграції з його кодуючою областю специфічної послідовності (як правило, селективного маркерного гену). Одна з задач спрямованого руйнування (“нокауту”) гену полягає в дослідженні впливу цього процесу на розвиток організму і фізіологічні функції, які в ньому здійснюються. Крім того, є надія, що трансгенні тварини з порушеннями в певному гені можна використовувати як модель для вивчення хвороб людини на молекулярному рівні.

24. Методи введення трансгену у геном тварин: використання сперматозоїдів у якості векторів трансгену, балістична трансфекція.

Використання сперматозоїдів в якості векторів трансгену. Використання сперматозоїдів в якості носіїв для трансгену можливо здатне забезпечити інтродукцію їх у геном зародку в найбільш оптимальний для цього період. Однак, це залежить від місця, в яке потрапляє чужорідна ДНК. Встановлено, що для бугаїв і кнурів здатність до зв’язування трансгену обмежена головним чином екваторіальною зоною і постакросомальним районом головки сперматозоїду. Потрапляння чужорідної ДНК в залишки цитоплазми у основи хвосту не призводить до трансгенозу.

Сперматозоїди мають спонтанну тенденцію до зв’язування трансгену, що присутній в культуральному середовищі. Експерименти показали, що з’єднання чужорідної ДНК і її проникнення в головку сперматозоїду можливо лише в тому випадку, коли сім’яна плазма ретельно віддалена.

Недавні дослідження виявили, що переніс трансгенів за допомогою сперматозоїдів в геном зиготи може здійснюватися не лише в умовах in vitro, але і при заплідненні in vivo. В цих експериментах відмиті від сім’яної плазми сперматозоїди кнура утримували в культуральному середовищі з плазмідою, яка містила трансген, протягом 30 хвилин, після чого оброблені сперматозоїди центрифугували до об’єму 1 мл і вносили в кожен ріг матки за допомогою ін’єкції по 0,5 мл трансформованих сперміїв. Відсоток запліднення свиноматок склав 73 (16 свиноматок з 22), і 10 з 48 (21%) поросят виявилися трансгенними.

Використання сперматозоїдів в якості носіїв трансгену при заплідненні in vivo значно спрощує технологію отримання трансгенних тварин і може значно збільшити частоту інтеграції чужорідних генів.

25. Трансгенні тварийи зі збільшеною швидкістю росту та стійкістю до захворювань.

Одним з основних напрямків генної інженерії на першому етапі було зміна спадковості тварин відносно збільшення швидкості росту, підвищення надоїв і поліпшення якості продукції.

Ріст тварини є складним процесом, який залежить від дії генів, умов годівлі і факторів навколишнього середовища. З генетичної точки зору найбільш цікаві гени, що кодують протеїни каскаду гормону росту, а саме, безпосередньо гормон росту (ГР), рилизинг фактори гормону росту (РФ – ГР) і інсулінподібний фактор гормону росту (ІФ ГР).

Перші трансгенні миші з геном ГР були отримані у 1982 р. В них була встановлена підвищена швидкість росту (в чотири рази) і подвоєна жива маса.

Що стосується сільськогосподарських тварин, у трансгенних свиней і овець не спостерігалося відповідного прискорення росту, або підвищення його не перебільшувало 15-16% в порівнянні з контролем. Деякі дослідники пояснюють це тім, що піддослідні тварини походять з популяцій, в яких протягом десятиліть проводилася селекція за цим показником. Генетичний потенціал росту цих тварин, видимо, знаходиться недалеко від потенційного плато і тому додатковим введенням гену гормону росту можна досягти лише незначного ефекту у швидкості росту.

Поряд з цим, відмічено збільшення вмісту білку і зменшення вмісту жиру в тканинах трансгенних тварин з генами гормону росту, що значно підвищує якість і товарну цінність отриманих м’ясопродуктів. Так, товщина шпику у трансгенних свиней складає 7-8 мм проти контрольних 18-20 мм. Аналогічно трансгенні вівці мають жиру 5-7% в порівнянні з 25-30% у контрольної групи.

В наш час основними напрямками створення трансгенних тварин є:

-      стійки до захворюваньтварини;

-      тварини з покрашеним складом м’яса і молока;

-      тварини, які продукують біологічно активні речовини медичного і технологічного призначення.

Трансгенні тварини стійки до захворювань. Резистентність – це спадкова генетично обумовлена сприйнятливість тварин до певних мікроорганізмів, вірусів, шкідників або токсинів. Тому можливо отримати трансгенних тварин з чужорідними генами, які забезпечують несприйняття цих тварин до певних захворювань. Вторгненню і розмноженню збудників запобігають, головним чином, імунні механізми і експресія генів, що відповідають за синтез таких речовин, як інтерферони, нейропептиди, гормони і інтерлейкіни.

Досліджується можливість отримання трансгенних тварин, які здатні збільшити вміст лактоферину в тканинах молочної залози з метою підвищення резистентності до маститу.

Значний інтерес представляють дослідження стосовно отримання трансгенних тварин з генами антисмислової РНК (асРНК). Експресія її у клітинах викликає наступну гібридизацію із смислової РНК вірусу і, відповідно, інгібірування реплікації вірусного геному. Створені трансгенні кролі, кури, велика рогата худоба з геном асРНК проти вірусу лейкозу, стійки до зараження лейкозом.