Ферменти харчової промисловості, іммобілізація, нові властивості ферментів при їх іммобілізації.

Використання біологічних процесів і агентів для отримання харчових продуктів і поліпшення їх якості – найдавніша галузь біотехнології. Як відомо, всі живі організми містять значну кількість (сотні і тисячі) ферментів, основна функція яких полягає у проведенні, прискоренні і регуляції практично всіх хімічних реакцій, необхідних для життєдіяльності організму.

Завдяки високій каталітичній активності і специфічності деякі ферменти вже давно використовуються в різних галузях виробництва, в першу чергу, це комплексні ферментні препарати для гідролізу природних полімерів – білків, крохмалю, пектинів

Більш широке використання ферментів до останнього часу стримувалося рядом причин, з яких найважливішими є:

-      трудомісткість відділення ферментів від початкових компонентів і продуктів реакції після завершення процесу, внаслідок чого ферменти використовуються, як правило, одноразово;

-      нестійкість ферментів при зберіганні, а також при різних впливах (головним чином теплових);

-      трудомісткість очищення ферментів і отримання їх в достатньо активному вигляді.

Іммобілізація – обмеження рухливості молекул ферментів, основана на фізико-хімічних принципах, що дозволяють зміцнити структуру ферменту таким чином, щоб активний центр його молекули зберігав власну працездатність (каталітичну активність) тривалий час, не підлягаючи структурним змінам, що викликають порушення його конфігурації.

При іммобілізації ферменти з розряду гомогенних каталізаторів (тобто каталізаторів, що знаходяться в тій самій фазі, що й субстрати реакції) переходять у розряд гетерогенних (тобто тих, що утворюють особливу фазу, яка відокремлена від реагентів). Ферменти і реагенти можуть бути розділені, що дозволяє: а) в певний час зупинити реакцію; б) регенерувати (поновити) фермент після закінчення реакції і використовувати його для нового циклу біотехнологічного процесу; в) отримати продукт реакції без домішок ферменту, що має особливе значення для харчової і фармацевтичної промисловості.

Процес може бути чисельно реалізований в періодичному режимі з використанням одного той самого ферментного препарату. Ще важливіше можливість безперервного режиму з використанням відомого у хімічної технології принципу взаємодії рухливої і нерухливої фаз. Рухлива фаза – розчин, суспензія, емульсія реагентів – протікає через реактор, заповнений насадкою з іммобілізованим на носії біокаталізатором.

Фактором, що сприяє тривалому, в тому числі безперервному, функціонуванню іммобілізованих біокаталізаторів, є їх збільшена стабільність, зберігання активності тривалий час як при зберіганні, так і при біотехнологічному процесі.

Ферменти при іммобілізації набувають властивості, які не здатні для них у вільному стані. 

Стабілізація ферменту при іммобілізації. Включення ферменту в осередку полімерної структури, внутрі- і міжмолекулярні зшивання його, закріплення його на носії - все це зміцнює фермент в робочій конформації і запобігає руйнуванню і денатураційним перебудовам. Це пояснює збільшення стабільності іммобілізованого ферменту при тривалому зберіганні і функціонуванні, а також його більшу стійкість до впливу підвищеної температури, екстремальних значень рН, органічних розчинників. Якщо ферменти включені у мікропористий носій, полімерні структури або мікрокапсули, то вони також захищені від впливу мікроорганізмів.

Зміна функціональних властивостей ферментів при іммобілізації. На характеристики ферменту при іммобілізації суттєво впливає мікрооточення, що визначається природою носія. Так іммобілізація ферменту на аніонному або катіонному поліелектроліті зрушує його оптимум рН, відповідно, в лужний або кислий бік.

Іммобілізація викликає зниження ефективності інгібіторів ферментів. Однією з причин цього може бути ускладнення доступу інгібіторів до іммобілізованого ферменту.

Важливе практичне значення іммобілізації полягає в тому, що ферментам можна надати властивість функціонувати у неводному середовищі, зокрема в органічних розчинниках. Складається ніби двофазна система, оскільки носій ферменту утримує в собі воду, і завдяки цього водного мікрооточення зберігається каталітична активність.

58.Способи іммобілізації ферментів, продукти, що отримують за допомогою іммобілізованих ферментів.

Існує декілька способів іммобілізації ферментів.

Адсорбція або хімічне зв’язування – прикріплення ферментів к поверхні природних або синтетичних носіїв. Фермент фіксують на поверхні неорганічних (силікагель; пористе скло; пісок; глина, яку випалювали; кераміка; бентоніт; гідроксид титану, цирконію, заліза та ін.) і органічних (целюлоза, хітин та їх похідні; іонообмінні смоли; нейлон; поліетилен; полістирол) носіїв.

Існує тенденція використання синтетичних великопористих матеріалів, своєрідних “губок”, які поглинають клітинну масу. Поліуретан є дуже поширений губчатий матеріал, що створює тверду “піну” з відкритими чашечками. Цей матеріал у вигляді мілко нарізаних часточок вносять у біореактор з клітинами. Клітини, що проникають у чашечки носія, швидко ростуть. Така система використовується при очищенні стічних вод.

Іонний взаємозв’язок між ферментом і носієм є більш міцним, і підтримується завдяки певній іонній силі розчина тому можна використати різні носії. Якщо потрібно регенерувати (поновити) біокаталізатор, то заміною іонної сили розчину можна десорбірувати (вилучити) фермент.

Що стосується хімічного зшивання біокаталізаторів з носієм, то цей шлях іммобілізації відрізняється високою ефективністю і міцністю зв’язку. Використовують різні види хімічних взаємодій: утворення пептидних, ефірних, гідроксидних зв’язків; для зменшення труднощів при доступі реагентів до поверхні ферментів, біокаталізатор підшивають к носію через спейсер (довга послідовність хімічних груп), або роблять зшивку на відстані від активного центру ферменту.

Іммобілізація шляхом включення в полімерну структуру. Цим методом біокаталізатор вносять в полімерну структуру: отримують гранули, плівки, волокна, що містять фермент. Спосіб включення біокаталізатора в полімерну структуру визначається специфікою полімеру. В тому випадку, коли полімеризація мономерів залежить від катіонів, фермент вносять в розчин мономерів і суміш, що отримали, по краплинам додають до водного розчину, що містить певний катіон. Створюються сферичні полімерні часточки, в яких знаходиться іммобілізований фермент.

При використанні в якості носія колагену іммобілізація здійснюється при інтенсивному перемішуванні клітин ферменту в водному середовищі, що містить часточки цього нерозчинного у воді білку (колагену). Коли використовують желатин або агар-агар, то біокаталізатор вносять у нагрітий розчин цих полімерів з наступним охолодженням, яке викликає утворення гелю.

Іммобілізація шляхом інкапсуліровання. При цьому методі біокаталізатори покривають спеціальними напівпроникними оболонками, що виготовлені з різних матеріалів – целюлози, поліакрилату, полістиролу, поліуретану, поліефірів, полікарбонатів, ліпідів. Переваги методу в першу чергу полягають в тому, що через пори полімерної оболонки здатні проникати низькомолекулярні речовини, цільовий продукт реакції – затримується. Після закінчення процесу і ретельного відмивання від низькомолекулярних домішок, капсули руйнують в гомогенізаторі і відділяють при центрифугуванні від розчину, що містить концентрований, майже чистий цільовий продукт.

Для іммобілізації також використовують порожні волокна. Їх виготовляють з целюлози та її похідних, а також інших природних і синтетичних матеріалів. Розчин, в якому міститься біокаталізатор, вводять усередину порожнього волокна, і потім волокно “запечатують” з обох кінців. В порожнині волокна біокаталізатор не підлягає хімічній модифікації і зберігає властивості.

Іммобілізація шляхом поперечних зшивок. Метод полягає у хімічному зв’язуванні ферментних молекул між собою з формуванням конгломератів. Використовують бі- або поліфункціональні агенти, що мають дві або більш здатних до реакції груп і створюють зшивки між молекулами білків і інших біополімерів. Цей метод стабілізує конформацію внутріклітинних ферментів, запобігає впливу на них протеаз (речовин, що розщеплюють білки), попереджає автоліз (саморуйнування) клітин.

Це основні методи іммобілізації. Для кожного типу біокаталізаторів існують власні найкращі методи. Ізольовані ферменти в основному іммобілізують на поверхні носіїв або методом поперечної зшивки.

В наш час за допомогою іммобілізованих ферментів в промисловому об’ємі отримують безлактозне молоко і цукор з молочної сироватки.

Отримання безлактозного молока. Лактоза, або молочний цукор міститься в достатньо значній кількості в молоці і молочній сироватці. Він характеризується малою солодкістю і низкою розчинністю, його наявність викликає кристалізацію морозива та інших молочних виробів і продуктів, що є причиною погіршення смаку.

Молекули лактози розпадаються на глюкозу і галактозу при гідролізі під впливом лактази, або ?-галактозидази. Молоко після такої обробки набуває нові дієтичні властивості, оскільки певна частина населення не має можливості застосовувати молоко в зв’язку з наявністю в ньому лактози. Ця властивість організму має назву лактазна недостатність. Вперше безлактозне молоко було отримано в Мілані (Італія) фірмою „Сенрле дель Латте”. Стабільність іммобілізованого ферменту досить висока – через 50 діб безперервної роботи він зберігає 80% початкової активності. Продуктивність виробництва десять тон молока за добу.

Отримання цукру з молочної сироватки. Молочна сироватка містить до 5% лактози. Ферментативний гідроліз лактози відкриває нові можливості отримання цукрових речовин з нетрадиційної сировини, вносить певний внесок в рішення кормової проблеми і проблеми охорони навколишнього середовища, оскільки сироватка в значному ступені не утилізується. Перший промисловий процес гідролізу лактози в молочній сироватці за допомогою іммобілізованої лактази був реалізований у 1980 році разом англійською, французькою і американською компаніями. Потужність установки складає біля тисячі літрів при ступені конверсії лактози 80%. Цукри, що отримують, (глюкоза і галактоза) за солодкістю в півтори рази перебільшують солодкість харчового цукру у розрахунку на однакові економічні витрати.