Биотехнологические проблемы биомедицинской отрасли промышленности

Цель лекций – изучить биотехнологические проблемы биомедицинской отрасли промышленности. (ее надо разделить на 2 части, большая)

Ключевые слова (термины) – антибиотики, биосинтез, продуценты, культивирование, гомоны, контроль

План лекции:

1. Проблемы поиска, создания и применения антибиотиков. Продуценты антибиотиков. Механизмы биосинтеза и биотехнология антибиотиков.
2. Управляемое культивирование. Антибиотикорезистентность и технологические пути ее решения.
3. Особенности и преимущество использования методов биотрансформации для получения стероидных гормонов.
4. Технологические проблемы практического использования микробной трансформации стероидных гормонов и способы повышения эффективности этого процесса.
5. Проблемы связанные с внедрением системы GMP производства и контроля качества лекарственных средств.

1. Проблемы поиска, создания и применения антибиотиков. Продуценты антибиотиков. Механизмы биосинтеза и биотехнология антибиотиков. Антибиотики — самый большой класс фармацевтических соединений, синтез которых осуществляется микробными клетками. К этому же классу относятся противогрибковые агенты, противоопухолевые лекарства и алкалоиды. В 1980 г. мировое производство антибиотиков составляло примерно 25000 т, из них 17000 т — пенициллины, 5000 т — тетрациклины, 1200 т — цефалоспорины и 800 т — эритромицины. В 1945 г. Бротзу из Института гигиены в Кальари (Сардиния) выделил из пробы морской воды плесень Cephalosporium acremonium, синтезирующую несколько антибиотиков; один из них, цефалоспорин С, оказался особенно эффективен против устойчивых к пенициллину грамположительных бактерий.

Из нескольких тысяч открытых антибиотиков львиная доля принадлежит актиномицетам. Среди актиномицетов наибольший вклад вносит род Streptomyces, включая тетрациклины (один только вид Streptomyces griseus синтезирует более пятидесяти антибиотиков). Наиболее распространенными с коммерческой точки зрения оказались пенициллины, цефалоспорины и тетрациклины.

Начиная с середины 1960-х гг. в связи с возросшей сложностью выделения эффективных антибиотиков и распространением устойчивости к наиболее широко применяемым соединениям у большого числа патогенных бактерий исследователи перешли от поиска новых антибиотиков к модификации структуры уже имеющихся. Они стремились повысить эффективность антибиотиков, найти защиту от инактивации ферментами устойчивых бактерий и улучшить фармакологические свойства препаратов. Большинство исследований было сосредоточено на пенициллинах и цефалоспоринах, структура которых включает четырехчленное b-лактамное кольцо. Добавление к b-лактамному кольцу метоксильной (СН₃О)-группы привело к появлению цефамицинов, близких к цефалоспоринам и эффективных как против грамотрицательных, так и против пенициллиноустойчивых микробов. Полусинтез состоит в замене химическим путем одной боковой цепи b-лактамного кольца на другую в полученной ферментацией молекуле. Устойчивость к пенициллинам и цефалоспоринам связана с наличием ферментов, так называемых b-лактамаз, которые широко распространены среди бактерий, актиномицетов, цианобактерий и дрожжей. Так как гены, кодирующие эти ферменты, находятся в составе плазмид, устойчивость может передаваться при переносе плазмид от одного бактериального штамма к другому. Исследователи фирмы «Мерк, Шарп и Доум» открыли новый класс b-лактамных антибиотиков, тиенамицины, продуцируемых Streptomyces cattleya. Тиенамицины чрезвычайно эффективны против грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также способны ингибировать b-лактамазы, что значительно повышает возможности этих антибиотиков. К ингибиторам b-лактамаз относятся также клавулановая и оливановая кислоты, идентифицированные исследователями английской фармацевтической компании «Бичем». Компания выпустила новый антибиотик, аугментин, который представляет собой комбинацию b-лактамного антибиотика амоксициллина и клавулановой кислоты.

Антибиотики вырабатываются в результате совместного действия продуктов 10—30 генов, поэтому практически невозможно обнаружить отдельные спонтанные мутации, которые могли бы повысить выход антибиотика с нескольких миллиграммов на литр в штамме дикого типа до 20 г/л и более пенициллина или тетрациклина в промышленных штаммах Penicillium chrysogenum или Streptomyces auerofaclens. Эти высокопродуктивные штаммы были получены в результате последовательных циклов мутагенеза и селекции. В результате мутаций появились новые вторичные метаболиты, в том числе 6-деметилхлортетрациклин и 6-деметилтетрациклин. Определенные мутанты, так называемые идиотрофы, способны синтезировать только половину молекулы антибиотика, а среда должна быть обогащена другой ее половиной. Такая форма мутационного биосинтеза привела к открытию новых производных антибиотиков, среди них принадлежащие к аминоциклитольной группе.

Число противоопухолевых веществ микробного происхождения довольно ограниченно. Блеомицин, выделенный Умезавой с сотр. в Токийском институте микробной химии из культур Streptomyces verticilliis, представляет собой гликопептид, который действует, разрывая ДНК опухолевых клеток и нарушая репликацию ДНК и РНК. Другая группа противоопухолевых агентов создана на основе комбинации аминогликозидной единицы и молекулы антрациклина. Недостатком обоих соединений является их потенциальная опасность для сердца.

В медицине применяют также аминокислоты, например, аргинин. В сочетании с аспартатом или глутаматом он помогает при заболевании печени. K-Na-аспартат снимает усталость и облегчает боли в сердце, его рекомендуют при заболевании печени и диабете. Цистеин защищает SH-ферменты в печени и других тканях от окисления и оказывает детоксицирующее действие. Он проявляет также защитное действие от повреждения, вызываемых облучением. Дигидроксифенилаланин и D-фенилаланин эффективны при болезни Паркинсона. Из полиаминокислот получают хороший материал для хирургии.

В медицине также используют зеленую водоросль Scenedesmus. Ее культивируют в жидкой питательной среде (установки дают до 80 тонн водорослей в год), извлекают и проводят экстракцию этиловым спиртом. Биомассу отделяют и подвергают ферментативному гидролизу щелочной протеазой. Около 50% белков при этом распадается до пептидов. Гидролизат содержит почти все незаменимые аминокислоты, представляет собой порошок желтовато-зеленого цвета с приятным запахом и вкусом. Используется этот продукт для быстрого восстановления организма, а также как компонент косметических средств. Если вместо обработки этанолом провести двукратную экстракцию дистиллированной водой, а затем высушить, то получается порошок светло-желтого цвета. Его используют как биостимулятор и готовят из него препараты для лечения плохо заживающих ран.

Еще в начале 90-х годов появились статьи, в которых рассматривались перспективы использования сапротрофной микрофлоры как продуцента биологически активных веществ (БАВ). Предполагается вводить в организм сапрофитные микроорганизмы, которые могли бы жить в условиях симбиоза с нормальной микрофлорой организма. Вещества, вырабатываемые бактериальными штаммами включаются в систему биохимических процессов организма. В случае нарушения нормального биохимического статуса организма они корректируют его, а при патологическом процессе – задерживают его или способствуют прекращению. Такое введение получило название «микробиологическая подсадка». К 1992 году было описано уже более 50 таких штаммов и проанализирован диапазон биологических эффектов секретируемых БАВ.

Для лечения широкого спектра заболеваний (бактериальные инфекции кишечника, дыхательных путей, гнойных инфекций, аллергий) успешно применяются штаммы Bacillus subtilis (препарат «Бактисубтил», например, используют при лечении диареи). Штаммами E. coli лечат ряд кишечных заболеваний. БАВ, секретируемые сапротрофами, могут регулировать ферментативные процессы в организме и вступать во взаимодействие с поступающими в организм ксенобиотиками. Штаммы можно получать непосредственно от человека, тогда они будут представлять его естественную микрофлору.

Можно целенаправленно выводить лабораторные мутантные штаммы, в том числе методами генной инженерии и вводить их в организм. Способы введения могут быть различны: капсулы, растворимые в кишечном соке, культуры штаммов-продуцентов на пленочной основе, в виде свечей, а при легочных заболеваниях – в виде аэрозолей.

Новым направлением в медицине является использование ферментных препаратов типа «контейнер», изготовление которых стало возможным появлению и совершенствованию методов иммобилизации веществ. Эти препараты представляют собой микросферы с более или менее твердой и проницаемой оболочкой. Назначение этих лекарственных препаратов различное. Первым типом «искусственных клеток» следует назвать микрокапсулы. Фермент, находящийся внутри оболочки, не контактирует с жидкостями и тканями организма, не разрушается протеиназами, не ингибируется, не вызывает иммунного ответа организма. Основное достоинство микрокапсул заключается в том, что их можно имплантировать в нужное место, например в непосредственной близости от опухоли. При этом микрокапсула с соответствующим содержанием будет перерабатывать метаболиты, необходимые для роста опухолевой ткани, и эта ткань не будет развиваться. Капсулы могут содержать микроскопические участки тканей. Например, имеются экспериментальные данные по созданию депо инсулина путем имплантации микрокапсул, содержащих островки Лангерганса, синтезирующие в поджелудочной железе инсулин. Известно, что терапии диабетических заболеваний уделяется много внимания. Имплантация лекарственного начала избавила бы пациентов от ежедневных инъекций инсулина. Следует учитывать, что микрокапсулы, вводимые в кровь, могут забивать кровеносные сосуды и, следовательно, являться причиной образования тромбов. Однако эффективность микрокапсул при использовании их в виде колонок для диализа в аппарате «искусственная почка» несомненна. При этом объем аппаратов и, соответственно, количество необходимых и очень дорогих растворов резко сокращается. Например, для микрокапсулированной «искусственной почки» требуется колонка объемом всего 30 мл, которая работает почти в 100 раз быстрее обычного аппарата. Развитие такой техники сдерживается пока высокой стоимостью, а также необходимостью использовать уже существующую тоже очень дорогую технику. Вероятно, ферментные реакторы на микрокапсулах будут применяться для деградации недиализуемых материалов.

Внутрь микрокапсул могут быть включены магнитные частицы. В этом случае извне подводят магнитное поле и препарат удерживают вблизи органа-мишени.

В ряде случаев используются высокомолекулярные соединения, растворимые в определенных условиях и сохраняющие высокую прочность оболочек в других. Так ведет себя ацетилфталилцеллюлоза, микрокапсулы из которой интактны в желудочном соке и растворяются в кишечнике, освобождая содержимое. Сейчас интенсивно исследуются свойства микрокапсул, стенка которых состоит из оболочек эритроцитов. Содержимое эритроцитов удаляется, а «тень» заполняется ферментом. Серьезные успехи достигнуты при лечении аспарагин-зависимых опухолей препаратами аспарагиназы в оболочках эритроцитов.

Используются оболочки и других клеток. Так, описаны лекарственные препараты, включенные в оболочки макрофагов. Последние имеют тенденцию накапливаться в очагах воспалений, а следовательно, могут транспортировать туда как низко-, так и высокомолекулярный лекарственный препарат. Существенной положительной стороной «теней» клеток в качестве носителя является их полная совместимость с организмом пациента, поскольку этот носитель готовят на основе клеток, выделенных из крови пациента, и возвращают их ему же с новым содержимым. Задача введения лекарственного препарата в клетки может быть решена путем создания контейнеров-переносчиков типа липосом или мицелл. Оболочка липосомы представляет собой однослойную или многослойную поверхность, образованную, в свою очередь, бислойной структурой, созданной соединениями, имеющими два гидрофобных, достаточно протяженных участка и гидрофильную группу. Гидрофобные концы слипаются между собой и образуют пленку, обе стороны которой гидрофильны. Липосома, специфически или неспецифически адсорбировавшись на клетке, может быть поглощена ею путем фагоцитоза, и фермент внутри высвобождается.

Хорошо известно, что протеиназы, расщепляя денатурированные белки, способствуют очищению ран, и следовательно, их заживлению. В этом направлении в клинической практике с помощью иммобилизованных протеиназ сделано многое. В качестве носителей для иммобилизации протеолитических ферментов наиболее употребимы волокнистые материалы на основе целлюлозы, поливинилового спирта, солей альгиновой кислоты, полиамидное и коллагеновое волокно. Готовят нити, в которые при формовании включают фермент и используют их в качестве шовного материала. Сравнительный анализ действия нативных и иммобилизованных протеиназ (в основном химотрипсина, трипсина, коллагеназы) показал, что уже на 2—4-й день рана очищается от некротических масс и по крайней мере вдвое быстрее наступает грануляция. Убедительные результаты получены при лечении трофических язв, лучевых язв кожи. Особенно эффективны иммобилизованные протеиназы при предоперационной подготовке и после пластических операций. Иммобилизованные протеолитические ферменты с большим успехом применяются в лечении гнойных заболеваний легких и плевры.

Все имеющиеся антибиотики по источникам выделения можно разделить на следующие группы.

1. Антибиотики, выделенные из грибов. Грибы — активные продуценты антибиотиков; из них выделены первые антибиотики, применяющиеся и сейчас в медицинской практике. Продуцентами антибиотиков явились, вопервых, некоторые штаммы Pcnicillium, из которых получается широко используемый в практике пенициллин. Наиболее активный препарат был получен из Реnicillium chrysogenum.

2. Антибиотики различного строения, полученные из актиномицетов, образуют большую группу. Актипомицеты-антагонисты составляют около 50% всех видов актиномицетов, обнаруживаемых в почвах, и в буквальном смысле слова оказались кладовой антибиотических веществ. Из Actinomyces globisporus получен стрептомицин. Открытие его в 1943 г. американским ученым А. Ваксманом ознаменовало новую эпоху в борьбе с туберкулезом. Благодаря стрептомицину такое заболевание, как туберкулезный менингит, ранее считавшееся смертельным, полностью излечивается. Из Actinomyces venezuella получен хлормицетии, из Actinomyces aureofaciens — ауреомицин, или биомицин, из Actinomyces noursei — нистатин, из Actinomyces kanamyceticus — канамицин и др. В общей сложности из актиномицетов выделено около 500 антибиотиков, по практическое применение нашло несколько десятков, остальные оказались либо неактивными в условиях организма, либо токсичными.

3. Антибиотики, выделенные из бактерий, составляют менее обширную группу. Наибольшее практическое значение имеют грамицидин и грамицидин С, выделенные из различных штаммов почвенных бактерий Вас. brevis; пиоциаиин — из Pseudomonas aeruginosa, продигиозин — из Serratia marcescens, субтилин —из Вас. subtilis. Из Вас. polymixa выделены полимиксины, которые нашли применение в клинической практике.

4. Антибиотики, выделенные из тканей животных; первым среди них явился лизоцим, обнаруженный в слезной жидкости, слюне и выделенный из яичного белка. Лизоцим оказывает бактериолитическое действие на грамположительные бактерии; менее чувствительны к нему грамотрицательные микроорганизмы. Лизоцим применяется для лечения язвенного процесса роговицы глаза, конъюнктивитов, гайморитов, гнойных процессов, осложнений ожогов, отморожений, вызванных бактериями, чувствительными к препарату.

Из тканей рыб выделен антибиотик экмолин, активный в отношении некоторых бактерий. Он применяется в сочетании с другими антибиотиками, усиливает их действие.

Особый интерес представляет антибиотик интерферон, образующийся в клетках организма (или в лабораторных условиях — в культуре ткани) под действием вирусов и являющийся фактором естественной защиты клетки от размножения вируса. Интерферон обладает широким антивирусным спектром, т. е. практически действует на все вирусы. Ему присуща высокая видовая специфичность: интерферон, полученный на клетках культуры ткани человека, способен оказывать действие только в организме человека.

Человеческий интерферон, выделенный из лейкоцитов Человека, обозначается Ифа. Одним из последних достижений генной инженерии является получение человеческого интерферона с помощью бактерий Е. coli, которые приобрели новое свойство вырабатывать интерферон, аналогичный лейкоцитарному интерферону, причем в большом количестве. Интерферон, полученный с помощью бактерий, успешно прошел биологические испытания. Изучение механизма действия интерферона показало, что в клетках, подвергшихся действию препарата, нарушается процесс трансляции вирусных информационных РНК, что приводит к подавлению образования полисом и отсутствию синтеза вирусных белков.

Интерферон применяется для профилактики и лечения гриппа и других вирусных респираторных заболеваний. В последние годы появились сообщения об эффективном действии интерферона при некоторых злокачественных новообразованиях.

5. Антибиотики, полученные из растений, так называемые фитонциды. Были открыты советским биологом Б. П. Токиным Б 1928 г. Он обнаружил, что многие высшие растения образуют летучие вещества, способные убивать микробы. Особенно сильными антибактериальными свойствами обладают лук, хрен, чеснок, свежесрезанная черемуха и др. Фитонциды не только защищают клетки растений от размножения в них фитопатогеиных микробов, но и активизируют жизненные функции растений. В чистом виде получить фитонциды очень сложно, так как по химической природе это летучие эфирные масла. Аллилсат — препарат, выделенный из чеснока, применяется при хронических колитах; аллилчеп — спиртовая вытяжка из лука; рекомендуется применять при. атонии кишечника и диареях. Широко используется для лечения ран, ожогов, трещин и т. п. натрия уснинат. Усниновая кислота выделяется из лишайников и оказывает выраженное антибактериальное действие на грамположительные бактерии. Новоиманин, получаемый из травы зверобой, действует на грамположительные бактерии, кокки. Хлорофиллипт выделен из листьев эвкалипта, обладает антибактериальной активностью при местном применении (ожоги, трофические язвы и т. п.), вводится также внутрь (при носительстве стафилококков в кишечнике); внутривенное введение его рекомендуется при септических состояниях, вызванных стафилококками, устойчивыми к антибиотикам.

К синтезу антибиотиков способны главным образом грибы из группы Aspergillales, актиномицеты и неко­торые другие бактерии. На первом месте по химическому многообра­зию синтезируемых веществ стоят стрептомицеты. К настоящему вре­мени подробно охарактеризовано более 2000 антибиотиков, однако в качестве химиотерапевтических средств применяется всего лишь около полусотни. Число описанных случаев антибиотических взаимо­действий гораздо больше, но многие группы микроорганизмов, в том числе не поддающиеся культивированию или с трудом культивируемые бактерии и низшие грибы, в этом смысле еще недостаточно изучены.

Развитие м/о продуцента антибиотиков имеют 2х фазный характер: 1)трофофаза или фаза сбалансированного роста характеризуется тем, что в культуре продуцента происходит быстрое накопление биомассы, сопряженное с интенсивным потреблением компонентов субстрата – углерода, азота, фосфора, некоторые сниженные рН среды. Биосинтез не осуществляется в эту фазу. 2)идиофаза – фаза несбалансированного роста, характеризуется снижением общего кол-ва биомассы вследствие автолиза части клеток. Среда обогащена продуктами обмена автолиза, возрастает значение рН, синтезируются антибиотики. Принцип 2х фазности развития м/о продуцента антибиотика характерен для организмов, развивающихся в периодической культуре при использовании в качестве посевного материала молодые культуры или споры. У многих м/о продуктивность снижается в присутствии избытка углерода, особенно глюкозы – накопленным катоболитным репрессором, поэтому источник углерода необходимо добавлять в среду небольшими порциями, другой способ получения мутантов устойчив к катоболитной репрессии. Во многих случаях источник азота – фосфор. Также могут снизить образование антибиотиков, поскольку фосфат ингибирует транскрипцию некоторых генов синтеза антиб, поэтому необходимо контролировать концентрацию в течение всей ферментации или получать мутанты менее чувствительные к этим регуляторам процесса. Сами антиб как конечный продукт могут осуществлять регуляцию своего синтеза при помощи обратной связи. Данный способ позволяет контролировать процесс образования антиб, т.е стимулировать выделение в окружающую среду и т.о снижать его концентрацию в клетке (метод проницаемости мемраны). Поскольку антиб вторичные метаболиты, они синтезируются из первичных, поэтому необх наличие предшественников. У грибов р.пеницилиум аминоадипиновая к-та является предшественником биосинтеза лизина и пенициллина. Поскольку лизин явл конечным продуктом он ингибирует первый фермент своего синтеза, что сопровождается снижению кол-ва всех промежуточных продуктов, в том числе и адипиновой к-ты, след-но синтез пенициллина снижается. При внесении адипиновой к-ты в проц ферментации ингибирующий эффект лизина снижается и наоборот. Если высокое содерж лизина, в среде наблюдается ингибир пенициллин. Наряду с аминоадипиновой к-ой продуцент пенициллина мецифалоспарина нуждается в цистеине и валине. М/о культивируют глубинным способом в условиях аэрации и ист питания. Механизмы устойчивости к собств антиб связаны с инактивацией их в клетке, либо выделение их в окружающую среду, кроме того устойчивость обусловлена модификацией на генном уровне.