Аминокислотный контроль метаболизма микроорганизмов и его значение при получении лекарственных средств. Регуляция усвоения азотосодержащих соединении.

Многие микроорганизмы усваивают органические соединения азота, однако из широкого многообразия таких соединений наиболее легко и быстро микроорганизмами усваиваются хлорид и сульфат аммония.

Центральными при синтезе азотсодержащих веществ являются реакции метаболизма с участием доноров аминогрупп: глутамата, глутамина и аспартата:

Глутамат + NH₃ + АТФ -» Глутамин + АДФ + Ф

Глутамин + а-Кетоглутарат + НАДФН -» 2-Глутамат + НАДФН⁺

Глутамат + Оксалоацетат -» Аспартат + а-Кетоглутарат

где Ф — фосфор неорганический.

На примере глутаминсинтетазы — важнейшего начального фермента азотного метаболизма, катализирующего переход аммиака в амидную группу (первая реакция), можно показать всю сложность регуляторных взаимодействий в сильно разветвленном метаболическом пути. Амидная группа глутамина является источником азота при биосинтезе шести соединений: двух ароматических аминокислот — триптофана и гистидина, а также АМФ, ЦТФ, глюкозамина-6-фосфата и карбамилфосфата. В опытах на клетках микроорганизма Е. coli показано, что любой из конечных метаболитов, находясь в насыщающей концентрации (имеются в виду потребности микроорганизма), может действовать по принципу ретроингибирования. Однако вызываемое при этом ингибирование неполно. Вместе с тем при росте числа метаболитов (в насыщающей концентрации) проявляется аддитивность, т.е. ингибирование фермента усиливается почти до полного исчезновения его активности, что получило название кумулятивного ретроингибирования. Также установлено, что все метаболиты-ингибиторы глутаминсинтетазы связываются с ферментом в своем определенном месте. Таким образом, при связывании они не мешают один другому, что имеет принципиальное значение для регуляции активности глутаминсинтетазы.

Однако существует и другой механизм регуляции этого сложного, состоящего из 12 субъединиц (молекулярная масса 12 кДа у каждой), фермента. С одной стороны, если культура микроорганизма оказывается в среде крайне бедной источниками углерода и энергии, но с избытком ионов аммония и глутамина, то активность глутаминсинтетазы резко снижается за счет более радикального механизма. Каждая из 12 субъединиц аденилируется, кова-лентно связывая по одному остатку АМФ. Активность фермента практически полностью исчезает, что благоприятно для выживания микроорганизма. С другой стороны, при переносе микроорганизма на среду, обедненную легко усваиваемым источником азота, глутаминсинтетаза деаденилируется и «мобилизует» свою активность.

У некоторых микроорганизмов система регуляции глутаминсинтетазы усложняется за счет того, что этот фермент существует в двух изоформах: в случае одной изоформы в систему регуляции включаются аденилирование — деаденилирование, в случае другой — обратимая избытком аммиака инактивация.

Наряду с перечисленными механизмами регуляции активности глутаминсинтетазы существует также еще один механизм внутриклеточной регуляции, позволяющий некоторым микроорганизмам бороться с недостатком азота в питательной среде за счет усиления экспрессии гена глутаминсинтетазы.

Ферменты, участвующие в усвоении азотсодержащих соединений, в большинстве случаев индуцибельны и подвержены закономерностям азотной репрессии, которая проявляется после превращения этих соединений в глутамин. При синтезе глицина и аланина α-аминогруппа глутамина реализуется с участием трансаминаз. При этом степень обеспеченности клетки азотом определяется соотношением глутамина с α-кетоглутаратом.

Также на разных клетках эукариот было показано, что дефицит источников углерода и энергии в питательной среде ведет к заметной протеолитической деградации ферментов, включенных в использование азотсодержащих соединений.

Регуляция усвоения азотсодержащих соединений у эукариот, прежде всего грибов, включая дрожжи, имеет много общего с прокариотами, хотя есть и отличия. Например, для грибов предпочтительнее использовать в качестве источника азота соли аммония и глутамин.

3 Катаболитная репрессия заключается в том, что глюкоза или другие быстро ассимилируемые субстраты вызывают сильную постоянную репрессию катаболических ферментов. Катаболиты, образующиеся из глюкозы, накапливаются в клетках и подавляют синтез ферментов, активность которых могла бы увеличить и без того уже большой внутриклеточный пул этих соединений.

Транзиентная репрессия проявляется в том, что при добавлении глюкозы к культуре бактерий, растущей на источнике углерода и энергии, который ассимилируется медленнее глюкозы, происходит резкое подавление синтеза соответствующего катаболического фермента. Это подавление длится короткое время (до одной клеточной генерации), затем синтез фермента возобновляется с низкой скоростью, характерной для роста в присутствии глюкозы. Важной особенностью транзиентной репрессии является то, что она может быть вызвана неметаболизируемыми аналогами глюкозы.

Исключением индуктора называют явление, которое состоит в том, что глюкоза препятствует поступлению субстрата-индуктора в клетку.

Наконец, катаболитное ингибирование — это подавление активности некоторых ферментов быстро образующимися продуктами катаболизма.

Катаболитной репрессией и исключением индуктора обусловлена диауксия — двухфазный рост бактерий в среде, содержащей в качестве источника углерода и энергии какую-либо пару соединений, например глюкозу и лактозу. В этих условиях сначала усваивается глюкоза, обеспечивающая более высокую скорость роста, и после ее исчерпания начинает использоваться лактоза.

При исследовании природы катаболитной репрессии было показано, что у Е. coli глюкоза подавляет синтез β-галактозидазы и галактозидпермеазы на уровне транскрипции 1ас-оперона. В связи с этим предполагалось, что действие катаболитов опосредовано белковым фактором, который напоминает репрессор и угнетает транскрипцию всех так называемых катаболит-чувст-вительных генов (оперонов).

В 1965 г. было обнаружено, что добавление глюкозы к клеткам Е. coli приводит к быстрому снижению внутриклеточной концентрации циклического 3',5'-аденозинмонофосфата (цАМФ) и накоплению его в среде роста. После удаления глюкозы содержание цАМФ в клетках восстанавливается. Эти эксперименты проводились на нерастущих клетках. Позднее было показано, что в растущих клетках глюкоза вызывает не экскрецию цАМФ в среду, а подавление его синтеза. Можно было предположить, что снижение уровня цАМФ и вызывает катаболитную репрессию. Такое предположение стало еще более обоснованным, когда выяснилось, что репрессирующее действие глюкозы на синтез ферментов можно частично снять добавлением экзогенного цАМФ.