Биотехнологические проблемы в пищевой индустрии

Содержание

№ п/п		стр
	Биотехнологические проблемы в пищевой индустрии:
	Биотехнологические способы решения проблемы дефицита белка.
	Биотехнология функциональных продуктов питания и биологически активных добавок к пище.
	Биотехнологические проблемы биомедицинской отрасли промышленности.
	Иммунобиотехнологии.
	Инженерная энзимология.
	Биотехнологические методы защиты окружающей среды.
	Проблемы сельскохозяйственной биотехнологии.
	Молекулярные механизмы внутриклеточной регуляции и их использование в биотехнологическом производстве.
	Мутасинтез.
	Мутагенез в селекции микроорганизмов.
	Клеточная и генетическая инженерия в селекции биообъектов.

 

 

Тезисы лекции №1

Биотехнологические свойства спиртовых дрожжей

Виды: S.cerevisiae, Schizosaccharomices pombe

1. Высокая бродильная активность.

2. Иметь и сохранять анаэробный тип метаболизма.

3. Микробиологическая чистота.

4. Устойчивость к продуктам своего ОВ и ОВ других м/о.

5. Устойчивость к резким изменениям состава среды, особенно к большим концентрациям солей и СВ ((осмоустойчивость).

6. При переработке мелассы полностью сбраживать раффинозу.

4. Пивоварение и виноделие. Дрожжи, использующие в пивоварни и виноделии. Сущность технологического процесса сбраживания пивного сусла.

Продукция пивоваренных заводов - пиво - является слабоалкогольным напитком. Приготовляется пиво в основном из ячменного солода и хмеля. На разных этапах технологического процесса ячменное сусло подвергается биохимическим превращениям под действием ферментов как солода, так и пивоваренных дрожжей. Необходимые для дрожжей питательные вещества - углеводы, аминокислоты и минеральные соли - содержатся в пивно Биотехнологические свойства пивных дрожжей

Вид: S.cerevisiae

Расы и штаммы пивных дрожжей

Раса 11 - самая популярная в России, идеал пивных дрожжей. С 1939 г. Быстросбраживающая, отсутствует глюкозная репрессия, неприхотлива к сырью (несоложеные материалы), используется для сбраживания плотного сусла (до 22% СВ), О₂-независима, пиво хорошо осветляется.

Общая характеристика пивных рас и штаммов

Неприхотливы к сырью: 11, 776.

Очень требовательны к сырью: 34, 308.

Высокая скорость размножения: 11, 776, 8аМ, f-чешская.

Быстросбраживающие: 11, 8аМ, f-чешская, 70, 34, 308.

Глубоковыбраживающие: Ф-2(гибридная, декстрины, до 93%), 776, 11, 8аМ, 34, 308.

Для сбраживания плотного сусла: 11, 776, 8аМ, 41, 46, S-львовская.

Пиво хорошо осветляется из-за хорошей флокуляции: 11, 776, 8аМ, 41, 46.

Устойчивость к инфекциям: f-чешская.

Для жесткой воды: 41, 46.

Степень популярности рас в России: 11 - 44,5% заводов России; 8аМ - 34,1%; 776 - 4,1%; 44, S-львовская, 34, 308 - 10%. На остальные (f-чешская, 41, 46, 70 и др.) - менее 10%.

Часто стали использовать верховые: Hensen, Egh, Верховые-2, Верховые-32.

N.B.!!! Часто используют комбинацию штаммов, но совмещать можно штаммы только с одинаковой скоростью размножения!!!

АСПД - активные сухие пивные дрожжи. Их получают в асептических условиях (т.е. это ЧК) и они обладают ксерорезистенстностью (К). К - способность сохранять жизнеспособность при обезвоживании и длительном хранении в обезвоженном состоянии.

Технология получения и применения АСПД была разработана в 1994 г. в России Мелединой для Российского пивоварения и пива в домашних условиях (аналог инстантным хлебным дрожжам).

Достоинства АСПД: жизнеспособность клеток АСПД - не 90%; длительное сохранение биотехн.св-в - 6 мес. при 4-10^оС; положительное влияние на вкусовой профиль пива (низкое содержание спиртов, лет.кислот).

Дозировка АСПД, приготовленных в лаборатории м/о, биохимии, технологии дрожжей С-Пбр. 10-15 г/л (расы 8аМ, 11, 34, 129, 140, 145, 146, 148 - низовые).

Дозировка АСПД, приготовленных в Финляндии (Crown - верховые) - 70 г/л.

Также готовятся АСПД в DVL, Великобритании (Safbrew S-33 верховые и низовые; Saflager-23 низовые).

м сусле.

Тезисы лекции №2

Получение белков из фототрофных микроорганизмов. Культуры микроводорослей и цианобактерий Направления совершенствования способов культивирования гетеротрофных и фототрофных микроорганизмов с целью получения белка.

Микроводоросли – уникальная группа фототрофных организмов, представленная многочисленными видами и широким ареалом распространения в природе (моря, реки, озера, почва). Это одноклеточные представители флоры c огромным потенциалом применения в разных отраслях науки и техники.

В 2010 г. мировое производство биомассы микроводорослей составляло более 7000 т., основная масса которого приходилась на США, Китай, Индию, Японию, Германию, Австралию, Израиль и Тайвань. Такие виды микроводорослей, как Chlorellavulgaris, Dunaliellasalina, Haematococcuspluvialis, Crypthecodiniumcohnii и Botrrycoccusbraunii, используются в пищевой и фармацевтической промышленности, производстве косметики, биотоплива и кормов для животных.

Специфика метаболизма микроводорослей, связанная с продуцированием метаболитовс ценными для человека свойствами, сделала их важным объектом биотехнологии. Крупнейшими коммерческими производителями биомассы микроводорослей являются компании Royal, DutchShell (Гавайские острова), AlgaeBioFuels (США), Aquaflow Bionomic Corporation (Новая Зеландия), Mitsubishi (Япония) и др. В Европе лидирующие позиции производства биомассы микроводорослей занимает компания Ingrepro B.V. (Голландия), имеющая большой опыт реализации технологических схем выращивания клеток микроводорослей для получения обогащенной липидами биомассы.

Клетки водорослей содержат значительное количество минеральных компонентов. Так, в биомассе спирулины содержится железо, фосфор, калий, магний, марганец, цинк, селен, а кальция в ней больше, чем в молоке. Морская одноклеточная красная водоросль порфиридиум - источник каррагинина, применяемого в пищевой промышленности, фармацевтике и как клеящее вещество в кожевенном и текстильном производстве.

Одна из актуальных задач биотехнологии - управляемый биосинтез пигментов микроводорослей, таких как хлорофиллы, каротины, ксантофиллы и др. Важно, что пигменты, получаемые из растительных компонентов, не токсичны. Наиболее перспективным источником каротина для биотехнологической промышленности признана зеленая водоросль Dunaliellasalina. В определенных условиях она способна к гиперсинтезу каротина, содержание которого в ее клетках может достигать 10%. Исследование биологии D. salina и экологических факторов, вызывающих ее переход к активному накоплению В-каротина в естественных условиях, показало, что биосинтез этого соединения - приспособительная реакция организмов на экстремальные условия роста, к которым относятся изменение солености и минерального состава среды, температуры и освещенности, а также сочетание комплекса этих параметров. В промышленных условиях, используя принцип разобщения клеточных функций деления и фотосинтеза, при управляемом биосинтезе В-каротина в клетках дуналиеллы можно получить большие объемы предшественника витамина А за небольшие интервалы времени. Однако технологический процесс выращивания D. salina пока далек от идеального вследствие физиолого-биохимической сложности метаболизма водорослей и его слабой изученности с точки зрения регуляции синтеза каротина в условиях промышленного процесса. Источником пигментов могут быть и сине-зеленые водоросли, из которых единственной в настоящее время микроводорослью, культивируемой для промышленного получения этих соединений, является спирулина. Ее хлорофиллы используют для окраски мыла, масел, жиров, алкогольных и безалкогольных напитков, духов, дезодорантов. В Японии хлорофиллами окрашивают рыбные пасты и другие кулинарные изделия, в Европе – масла, жиры, ароматические эссенции.

В качестве кормовых добавок в животноводстве и птицеводстве используются водоросли родов Chlorococcum, Spirogyra, Scenedesmus, Nostoc, Navicula, Nitzschia и др. Эти добавки повышают у животных иммунитет, возрастают их вес, плодовитость и выживаемость молоди, у птиц увеличиваются размеры яиц, усиливается яйценоскость. Поэтому в США фермерские хозяйства для выращивания крупного рогатого скота и птицы обеспечены водорослевыми водоемами, где отходы животноводства утилизируются водорослями. В результате 40% азота из сточных вод снова поступает в биомассу водорослей и поедается животными. А применение суспензии хлореллы и сценедесмуса в шелководстве способствует ускорению развития гусениц тутового шелкопряда, увеличивает его жизнеспособность и урожайность коконов.

Использование водорослей для решения продовольственной проблемы, связанной с поиском эффективных путей охраны окружающей среды, позволяет уменьшить антропогенную нагрузку на водные экосистемы, являющиеся сегодня основным источником пищи для человека и животных.

Практические подходы к использованию почвенных водорослей для повышения плодородия почв развиваются в двух направлениях. Во-первых, возможно активирование автохтонного комплекса почвенных микроводорослей, поскольку данные организмы как накопители органического вещества в водных и наземных экосистемах активнее увеличивают свою биомассу при внесении в почвы минеральных удобрений, более эффективных в присутствии органического вещества, в свою очередь стимулирующего развитие самих водорослей. Например, при весенней подкормке сельскохозяйственных культур, когда удобрения вносятся на влажную поверхность почвы, происходит бурное развитие водорослей, почва покрывается зеленым налетом – "цветет". Органическое вещество водорослей разлагается быстрее растительных остатков, что делает его более доступным для других обитателей биоценоза. Второе направление в интенсификации процесса повышения плодородия почв при помощи микроводорослей – внесение живых культур этих микроорганизмов в почву (альгализация), особенно в условиях поливного земледелия. Ее проводят до посева растений или при посеве вместе с семенами (например, хлопчатника), либо водоросли вносят после посева, что особенно эффективно на рисовых полях.

С научной и практической точки зрения актуальна разработка и исследованиеновых биотехнологических процессов, связанных с использованием микроводорослей в процессах очистки сточных вод с последующей трансформацией полученной таким образом возобновляемой биомассы в коммерчески значимые продукты.

Микроводоросли являются и основным источником получения полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), так называемых омега жирных кислот, играющих чрезвычайно важную роль в развитии человеческого организма и используемых в качестве добавок к детским молочным смесям, они снижают и риски кардиоваскулярных заболеваний.

Рыба и рыбий жир – основные источники ПНЖК, но их использование в качестве пищевой добавки ограничено рядом факторов. Это возможное накопление токсинов, неприятные запах и вкус рыбы, плохая устойчивость к окислению, наличие смешанных жирных кислот и невозможность употребления в вегетарианской диете. Уже сейчас единственным коммерческим источником получения докозагексаеновой кислоты являются микроводоросли, а другие кислоты, такие как эйкозапентаеновая, g-линоленовая и арахидоновая, находятся на стадии оптимизации получения с участием микроводорослей.

Микроводорослям отводят важную роль в решении ряда глобальных проблем, волнующих все человечество: продовольственной, медицинской, энергетической, охраны окружающей среды, освоения космического пространства и пр. Возможности широкомасштабного промышленного производства биомассы микроводорослей и расширение спектра их использования выдвигают ряд задач перед экологами, микробиологами и биотехнологами в области поиска высокопродуктивных штаммов и оптимизации условий их культивирования.

Тезисы лекции № 3

Фототрофные микроорганизмы - продуценты биологически активных добавок к пище (БАД).

Еще в середине прошлого века стали известны бактерии, имеющие в массе красный или зеленый цвет. Соответственно такой окраске они получили названия «пурпурные бактерии» и «зеленые бактерии». Дальнейшие исследования показали, что эти микроорганизмы содержат пигменты, похожие на хлорофиллы растений. Кроме того, было отмечено, что рост их зависит от наличия света или стимулируется в его присутствии. Поэтому неоднократно высказывалось предположение о способности пурпурных и зеленых бактерий к фотосинтезу. Окончательно это доказал Ван-Ниль, основная работа которого была опубликована в 1931 г. С этого момента начинается новый этап в изучении пурпурных и зеленых бактерий. Открытие бактериального фотосинтеза имело также большое значение для понимания сущности этого процесса у растений, поскольку наряду с некоторыми особенностями он характеризуется общими закономерностями.

В настоящее время фототрофные бактерии широко используют для исследования фотосинтеза в различных аспектах, особенно начальных стадий, поскольку они удобны для изучения этого сложного вопроса. Кроме того, пурпурные и зеленые бактерии интересны для выяснения организации фотосинтезирующего аппарата, путей биосинтеза пигментов, метаболизма углерода, эволюции фотосинтеза и фотосинтезирующих форм. Привлекают они к себе внимание и в связи с другими биологическими проблемами, в частности фиксацией молекулярного азота, а также круговоротом углерода и серы в природе. Сделаны первые шаги для практического использованияфототрофных бактерий при очистке сточных вод и для получения дешевого корма.

Фототрофные, или фотосинтезирующие, бактерии — типично водные микроорганизмы, распространенные в пресных и соленых водоемах. Особенно часто они встречаются в местах, где есть сероводород, как в мелководье, так и на значительной глубине. В почве фототрофных бактерий мало, но при затоплении ее водой они могут расти весьма интенсивно. Развитие фототрофных бактерий нередко легко обнаружить, не прибегая к постановке накопительных культур и микроскопическим исследованиям, так как многие из них способны образовывать ярко окрашенные пленки, а также обрастать подводные предметы. Такие макроскопические скопления наблюдаются в серных источниках, лиманах, бухтах, озерах и прудах. Иногда в результате массового развития фототрофных бактерий меняется даже цвет всей воды в водоеме или отдельные ее слои становятся окрашенными. Последнее явление довольно часто имеет место в некоторых озерах, содержащих в придонных слоях сероводород.

По всем данным пурпурные и зеленые бактерии — наиболее древние фотосинтезирующие организмы, существующие в настоящее время. Из других фототрофов к ним близки по организации сине-зеленые водоросли, которые в последнее время часто называют сине-зелеными бактериями или цианобактериями, поскольку они относятся к прокариотам. Предлагается даже ввести следующие названия: Rhodobacteria (пурпурные бактерии),Сhlогоbacteria (зеленые бактерии) и Cyanobacteria (сине-зеленые бактерии). Однако только пурпурные и зеленые бактерии осуществляют фотосинтез без выделения кислорода. Кроме того, они отличаются от остальных фотосинтезирующих форм, в том числе и от сине-зеленых водорослей, составом хлорофиллов и других пигментов.

Биологически активные кормовые добавки (БАКД) и минерально–витаминные премиксы (МВП) играют огромную роль в вопросах интенсификации животноводства и культивировании новых пород. В условиях резкого спада производства и роста цен на высокобелковые корма животного и растительного происхождения, поиски нетрадиционных источников кормовых добавок и витаминов имеют актуальное значение.

Одним из таких рекомендуемых добавок является выращенная биомасса сине–зеленой водоросли «спирулинаплатенсис» (Spirulina platensis Geitl.) в виде сухих, жидких или пастообразных препаратов в качестве кормовой добавки для животных и птицы.

Спирулина обладает широким спектром биологической активности, а потому использование её в качестве кормовой добавки позволит:
– повысить иммунитет к простудным и инфекционным заболеваниям;

– нормализовать обмен веществ;

– улучшить состояние кожного и волосяного покрова;

– укрепить костяк;

– улучшить функции пищеварительной системы;

– нейтрализовать и вывести из организма токсины, радионуклиды.

То есть, спирулина платенсис – не только ценная кормовая добавка, но и лекарственный препарат, не вызывающий побочных явлений у животных и птиц.

Получение БАД. В процессе эволюции, проходя жесткие условия конкуренции, клетки спирулины приобрели способность к делению при благоприятных условиях с огромнейшей скоростью – удвоение биомассы за пять часов. Этот факт можно проиллюстрировать так: при правильном культивировании спирулины она растет настолько быстро, что может обеспечить в 20 раз больше протеинов с единицы культивационной площади, чем соя, и в 200 раз больше, чем говядина. Она не нуждается в черноземе, в то время как на получение 1 кг кукурузного протеина уходит 22 кг поверхностного почвенного слоя, а на получение 1 кг говяжьих протеинов - 45 кг зеленой массы.

Благодаря своим ценным биологическим и физиологическим свойствам, биомасса спирулины вот уже около полувека - является предметом бизнеса во многих странах мира. Так, годовое производство спирулины в 2005 г в Мексике составило 183 тонн, в Японии – 190 тонн, в Индии и Китае – по 170 тонн.

Поначалу сбор спирулины проводили непосредственно в природных щелочных водоемах Африки и Америки, в которых из-за их удобного географического положения и химического состава воды сложились благоприятные условия для роста спирулины.

В дальнейшем потребность в спирулине стала возрастать, что привело к разработке новых технологий выращивания спирулины в искусственных водоемах.

В последние годы появился ряд серьезных технологических разработок в области культивирования спирулины. Благодаря отдельным ноу-хау, техническим и технологическим решениям, продуктивность спирулины можно увеличить в 5-10 раз (!) по сравнению с известными аналогами. Причем, качественный состав ее в этом случае далеко превосходит состав биомассы, полученной в условиях тропиков или добытой в природе. Кроме того, эта спирулинаотличается высокой чистотой и концентрацией биомассы.

В настоящее время спирулина используется в 70-ти странах мира. Наиболее крупные ее производства находятся в США, Калифорнии, на Гавайях и в Китае. Среди стран СНГ спирулину производят у нас в Украине, а также России и Молдавии.

Существует несколько различных технологий культивирования спирулины – массовая культура под открытым небом в бассейнах при искусственном освещении, интенсивное культивирование в стеклянных тубах, теплицах, а также в замкнутых аппаратах по типу современных микробиологических производств. Примером таких закрытых установок есть фотореакторы каскадного типа, позволяющие выращивать очень чистую спирулину с использованием как искусственного, так и естественного освещения.

Разработанный способ отбора клеток спирулины из питательного раствора, дает возможность отбирать наиболее зрелые клетки и не допускает перезревания культуры. Специальная сушка позволяет обеспечить свежесть и чистоту водоросли, сохранить ее биологическую активность, а возможность использования солнечного света дает экономию более 80% электроэнергии.

Каждый их этих способов имеет свои технологические различия, преимущества и несовершенства, но цель у всех одна – получение максимального выхода биомассы.

Традиционный подход к производству биологически активных добавок на основе Spirulina Platensis предполагает удаление влаги из клеток микроводорослей спирулины методом термо- и криосушки. Это, конечно, облегчает жизнь производителям: сокращаются затраты на производство продукта, его перевозку, хранение и т.д. Однако при этом потребитель соответственно получает лишь отдаленное подобие биологической активности спирулины. Дело в том, что в период удаления внутриклеточной воды из спирулины (сушки) ее белковые комплексы денатурируют, т.е. белок теряет четвертичную и третичную структуры, которые поддерживают атомы водорода, входящие в состав воды. При этом теряется аура живых клеток спирулины. Одним словом, сухая спирулина – это мертвый продукт.

Применение БАД в пищевой промышленности. В соответствии с действующим в нашей стране санитарным за­конодательством под термином «пищевые добавки» понимают при­родные или синтезированные вещества, преднамеренно вводи­мые в пищевые продукты с целью придания им заданных свойств, например органолептических, и не употребляемые сами по себе в качестве пищевых продуктов или обычных компонентов пищи. Пи­щевые добавки можно вводить в пищевой продукт на различных этапах производства, хранения либо транспортирования в целях улучшения или облегчения технологического процесса, увеличе­ния стойкости к различным видам порчи, сохранения структуры и внешнего вида продукта или намеренного изменения органолептических свойств.

Большинство таких добавок не имеют, как правило, пищевого значения и в лучшем случае являются биологически инертными, а в худшем — биологически активными и небезразличными для организма. В то же время любое химическое соединение или веще­ство в определенных условиях может быть токсичным. В этой связи более уместно говорить о безвредности, под которой следует по­нимать не только отсутствие каких-либо токсичных проявлений, но и отдаленных последствий: канцерогенных и коканцерогенных свойств (способность вызывать развитие злокачественных опухо­лей), а также мутагенных, тератогенных, гонадотоксических (спо­собность вызывать мутации, уродства) и других свойств, влияю­щих на воспроизводство потомства.

Немаловажным фактором является также возможное взаимо­действие тех или иных веществ, применяемых в качестве пищевых добавок, с вредными химическими веществами, которые попада­ют в организм человека из окружающей среды (профессиональ­ные вредности, неблагоприятная экологическая обстановка). Вве­дение пищевых добавок с точки зрения технологии может быть направлено:

- на улучшение внешнего вида и органолептических свойств пи­щевого продукта;

- на сохранение качества продукта в процессе его хранения;

- на ускорение сроков изготовления пищевых продуктов.

В соответствии с технологическим предназначением пищевые добавки можно сгруппировать следующим образом.

A. Пищевые добавки, обеспечивающие необходимые внешний вид и органолептические свойства продукта. Эта группа включает:

- улучшители консистенции;

- пищевые красители:

- ароматизаторы;

- вкусовые вещества.

Б. Пищевые добавки, предотвращающие микробную или окис­лительную порчу продуктов (консерванты). К ним относятся:

- антимикробные средства — химические, биологические;

- антиокислители (антиоксиданты), препятствующие химической порче продукта (окислению).

B. Пищевые добавки, необходимые в технологии производ­ства пищевых продуктов:

- ускорители технологического процесса;

- фиксаторы миоглобина;

- технологические пищевые добавки — разрыхлители теста, желеобразователи, пенообразователи, отбеливатели и др.

Г. Улучшители качества пищевых продуктов.

 

Пищевая добавка может состоять из одного единственного хи­мического вещества, быть сложной смесью или представлять со­бой естественный продукт. Необходимость полной информации о химическом составе, в том числе описание, сырье, методы про­изводства, анализ загрязнителей, одинаково относится к каждо­му типу добавок. В то же время требования к получению регламен­тирующих данных о химическом составе пищевых добавок могут быть разными в зависимости от вида оцениваемого вещества. На­пример, если добавка состоит из одного вещества, практическиневозможно удалить все загрязнители при его производстве. По­этому в данном случае проводится в основном анализ самых зна­чительных компонентов и предполагаемых загрязнений, причем особое внимание уделяется потенциально токсичным загрязните­лям. Для коммерчески производимых сложных смесей (таких, как моно- и диглицериды и т.п.) нужна информация в отношении тех веществ, которые выпускает промышленность. В этом случае особого внимания заслуживают описания технологического про­цесса, подкрепленные данными анализа компонентов различных коммерческих продуктов.

Для пищевых добавок, производимых из природных продук­тов, чрезвычайно важно определить источник и методы произ­водства. Данные о химическом составе должны включать анализ общих химических характеристик, таких, как содержание белков, жиров, углеводов, минеральных веществ, влаги, а также специ­фических токсичных загрязнителей, которые переходят в продукт из сырья или химических соединений, используемых при произ­водстве добавки.

Вопросы для самоконтроля:

 

1. Объясните понятие «пробитики».

2.Роль пробиотиков в жизни человека, свойства и критерии отбора штаммов пробиотических микроорганизмов.

3.Объясните понятие «биологически активные добавки».

4. Классификация БАД.

5. Значение БАД в создании современных продуктов питания.

6. Роль биологически активных добавок в питании человека.

 

Тезисы лекции № 4

Тезисы лекции №5

Иммунобиотехнологии

Цель лекций –

 

Ключевые слова (термины) -

 

План лекции:

1. Перспективные направления современной иммунобиотехнологии. Гибридомная технология.
2. Моноклональные антитела. Использование антител для очистки биологических жидкостей. Возможности использования моноклональных антител при решении проблемы безопасности лекарственных средств (мониторинг лекарственных средств).
3. Типы вакцин и их конструирование. Культуральные и генноинженерные вакцины. Субъединичные вакцины. Современные вакцины. Современные способы и направления разработок. Пептидные вакцины на примере противоящурной вакцины. Аутовакцины. Липосомальные вакцины. Технологии совершенствования липосамальных вакцин.
4. Производство сывороток. Современные прививочные препараты. Иммуносенсоры. Производство иммуномодуляторов, иммуностимуляторов и иммунодепрессантов. Проблемы биобезопасности вакцинных препараторов.

1. Современная наука достигла такого этапа развития, когда для исследования необходимы реактивы, способные взаимодействовать с индивидуальными молекулами либо с различными участками макромолекул, что обеспечивает точность качественного и количественного анализа. Этим критериям идеально соответствуют молекулы иммуноглобулинов. Так как данные реагенты необходимы в большом количестве, перед исследователями была поставлена задача наладить производство антител одной специфичности (моноклональных) в промышленном масштабе. Было предпринято множество попыток, из которых следует отметить методики получения моноклональных антител из опухолей лимфоидных тканей и производства поликлональных антисывороток. Предложенные методы имели целый ряд недостатков и не удовлетворяли предъявляемым требованиям. Было невозможно получить опухоли, синтезирующие антитела на интересующие исследователя антигены, а поликлональные антисыворотки обладали перекрестной реактивностью и содержали низкое количество моноклональных антител. В связи с этим революционным достижением послужила разработка методики получения лимфоидных гибридом, позволяющая получать моноклональные антитела практически на любой антиген в необходимых количествах.

Лимфоидные гибридомы — это бессмертные клеточные клоны, продуцирующие антитела одной специфичности (моноклональные). Гибридомы получают посредством слияния раковой клетки лимфоидного ряда и «нормального» зрелого лимфоцита. От раковой клетки гибридома наследует способность к неограниченной пролиферации, а от «нормального» лимфоцита — способность синтезировать антитела. Гибридомы синтезируют на основе банка клеток-носителей (линий раковых клеток), клон лимфоцитов, в принципе, можно получить практически на любой интересующий антиген. На данный момент в мире существует более 50 тыс. гибридом. Получены гибридомы на основе клеток мышей, крыс, золотистого и китайского хомячков, клеток человека и т.д. Первоначально были получены гибридомы на основе клеток мыши линии balb/c, технология получения которых была разработана ранее. В настоящее время банк гибридом пополняется посредством получения гибридом на интересующие исследователей антигены. Гибридомная технология на данном этапе является единственной технологией, позволяющей получать моноклональные антитела в необходимом количестве, и занимает ведущее место в коммерческом обороте продуктов биотехнологии.

Технология лимфоидных гибридом была разработана в 1975 году Мильштейном и Келлером, и уже к 1977 году ими было получено 16 типов гибридом, синтезирующих различные типы моноклональных антител. Первоначально гибридомная технология строилась на основе следующих разработок: имелись линии миеломных клеток мышей balb/c (дефектные по некоторым ферментам метаболизма нуклеиновых кислот, что являлось необходимым условием для селекции получаемых гибридом), полученные в результате развития методов получения миелом, посредством введения инертного пластика и минеральных масел в виде подкожных инъекций мышам; разработаны методы слияния клеток с помощью вирусов (вирус Сендай) и полиэтиленгликоля; разработаны методики избирательной селекции клеток с помошью среды ГАТ. Главной заслугой Мильштейна и Келлера явилась непосредственно разработка методики, а также возможность использования получаемых гибридом для широкомасштабного производства моноклональных антител. Возможности гибридомной технологии были оценены по достоинству, и в 1984 году Келлер и Мильштейн были удостоены Нобелевской премии. В последующие годы были получены другие линии клеток-носителей, в том числе и линии клеток человека, однако наиболее распространенным типом гибридом являются гибридомы на основе мышиных клеток. Следует заметить, что, несмотря на огромную практическую значимость гибридомная технология решила и ряд теоретических затруднений, в частности это был окончательный и, вероятно, самый весомый довод в пользу клонально-селективной теории синтеза антител.

Гибридомная технология, в ее классическом варианте, выполняется в несколько этапов. В качестве предпосылок, необходимо иметь линию раковых клеток-носителей, дефектных по одному из ферментов (тимидинкиназе (ТК) или гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазе (ГГФРТ)), что само по себе определяет выбор способа селекции образующихся гибридом; разработанную процедуру слияния клеток; антиген, антитела на который необходимо получить исследователю, методики определения продуцируемых гибридомой антител с целью клонирования необходимой линии. При наличии всего вышеперечисленного процедура получения лимфоидных гибридом выглядит следующим образом (рис 1):

1. иммунизация животных выбранным антигеном и выделение «нормальных» лимфоцитов иммунизируемого животного после определения максимального титра интересующих исследователя антител;

2. культивирование раковых клеток-носителей;

3. проведение слияния клеток-носителей с «нормальными» лимфоцитами (в классическом варианте с помощью полиэтиленгликоля);

4. проведение процедуры селекции образующихся гибридом с помощью среды ГАТ. Клетки, имеющие дефект по одному из перечисленных ферментов (ТК или ГГФРТ), не способны расти в ГАТ среде, содержащей гипоксантин, тимидин и аминоптерин. Аминоптерин блокирует синтез dTMP посредством ингибирования дигидрофолят-редуктазы.

Клетки, имеющие дефект по одному из перечисленных ферментов (ТК или ГГФРТ), не способны расти в ГАТ среде, содержащей гипоксантин, тимидин и аминоптерин. Аминоптерин блокирует синтез dTMP посредством ингибирования дигидрофолят-редуктазы. Следовательно, в среде, содержащей аминоптерин, синтез пиримидинов может происходить только из готовых предшественников (из тимидина в данном случае). Клетки, содержащие дефектную ТК не способны расти в ГАТ среде. Клетки, содержащие дефектную ГГФРТ, способны синтезировать пурины из предшественников, но не из готовых продуктов (из гипоксантина в данном случае), следовательно, в ГАТ-среде данные клетки погибнут. В том случае, если произойдет слияние клеток таким образом, что у полученных гибридов дефектные ГГФРТ и ТК будут дополнены функциональными ферментами, то данные гибриды выживут в ГАТ-среде.

К таким клеткам относятся гибридные клетки, получившие оба фермента от родительских клеток (по одному от каждой). При слиянии миеломных клеток с лимфоцитами можно использовать опухолевые клетки, дефектные только по одному из ферментов, т.к. лимфоциты не способны размножаться в культуре и погибают через некоторое время естественным путем (полуселективный способ) (рис 2);

5. проведение процедуры культивирования полученных лимфоидных гибридом и выделение клона гибридом, продуцирующего необходимые антитела (выделение клона, продуцирующего нужные исследователю антитела необходимо, т. к. только в этом случае будет происходить наращивание концентрации гибридом данного типа);

6. проведение изучения полученных гибридом;

7. наращивание концентрации моноклональных антител in vivo (с помощью асцитных жидкостей) или in vitro.

Такова классическая схема получения лимфоидных гибридом, предложенная Келлером и Мильштейном. До настоящего момента основная схема существенным образом не изменилась. С учетом всех вышеперечисленных предпосылок данная методика принята во множестве лабораторий мира и вполне оправдывает себя. Изменения касаются некоторых пунктов и в основном являются результатом модификации существующей процедуры под нужды конкретной лаборатории. Следует отметить следующие изменения:

· Использование в качестве клеток-носителей других линий клеток, не имеющих дефект по вышеперечисленным ферментам, приводит к необходимости изменения процедуры селекции образующихся гибридом, т. к ГАТ-среда в данном случае не работает. Таким образом, разрабатываются методы селекции, подходящие для выбранных клеток. Примером такой модификации может служить метод «интерферон-вирус», разработанный для клеток человека J-96 и мышиных клеток L929;

· В связи с усовершенствованием методов электрослияния клеток происходит его активное внедрение в гибридомную технологию в качестве альтернативы слияния с помощью этиленгликоля, вытеснившего в свое время методику слияния с помощью вирусов (вирус Сендай);

· В качестве клеток-носителей все чаще начинают использование клеток других типов, полученных либо от организма одного вида, либо даже от разных видов. Разработка подобных методов позволяет не только изучить особенности функционирования клеток как таковых, но и имеет колоссальный практический интерес, т.к. позволяет решить проблему получения человеческих гибридом.

Одной из основных трудностей, возникающих при получении лимфоидных гибридом, является наличие феномена элиминации хромосом, заключающегося в потере определенных хромосом в процессе культивирования. Данный процесс может служить причиной потери клеткой признаков, необходимых исследователю, в частности, потери способности к неограниченной пролиферации у раковых клеток и способности к синтезу иммуноглобулинов у гибридом. В данном процессе имеется корреляция между количеством хромосом и степенью их элиминации. Чем больше хромосом в клетке, тем меньше вероятность по<