Проблемы связанные с внедрением системы GMP производства и контроля качества лекарственных средств.

Целью мировой системы лекарственного обеспечения населения является обеспечение самыми необходимыми лекарственными средствами, требуемого качества, в достаточном количестве и по доступной цене.

Достигаются эти цели ориентируясь на национальные и социально-демографические особенности, на степень развития аптечной службы, отечественной фармацевтической промышленности и т.д.

На всех фармацевтических рынках стран СНГ растет роль государства: реализуются различные национальные программы, осуществляется государственная политика поддержки отечественных производителей. Во многих странах СНГ идет реформирование системы здравоохранения в соответствии со стратегическими целями: улучшение демографической ситуации, повышение качества жизни и реальных доходов населения, обеспечение относительной независимости страны от импорта жизненно необходимых лекарств.

Для Казахстана, важным событием в экономическом и политическом плане было создание таможенного союза, а также вступление России в ВТО и ожидаемое вступление самого Казахстана в данную международную организацию. Данное событие непременно должно оказать влияние и на развитие фармацевтической отрасли в целом, привести к росту конкуренции на рынке, следующим важным событием будет внедрение стандартов GMP на производственных фармацевтических площадях Таможенного союза до конца 2014 года. Значительные темпы роста фармацевтических рынков России, Белоруссии и Казахстана связаны как с наибольшей численностью населения, так и с реформами в сфере здравоохранения среди стран СНГ.

Совокупный рынок таможенного союза оценивается в 17млд долларов США, в то время как емкость фармрынка Казахстана на 2010г. составляла $1 млрд. и ежегодно увеличивалась на 15 %. Через пять-семь лет эта цифра достигнет $2 млрд. Основной задачей является увеличение к концу 2014 года отечественных лекарственных средств на внутреннем рынке с 30 до 50% в натуральном выражении.

В мировой практике одним из важнейших документов, определяющим требования к производству и контролю качества лекарственных средств, являются “Правила производства лекарственных средств” – “Good Manufacturing Practice for Medicinal Products (GMP)”. В Казахстане созданы все предпосылки для развития отечественного производства, но обязательное условие – это чтобы предприятие соответствовало стандартом GMP.

Главная поддержка со стороны государства — это подписание долгосрочных договоров на поставку, в которых гарантируется определенный объем сбыта при обязательном условии внедрения местными компаниями стандартов надлежащей производственной практики (GMP). Эти меры гарантируют возврат инвестиций. На сегодняшний день, по данным ‘СК-Фармация’, уже подписано 14 долгосрочных договоров поставки.

Правила GMP устанавливают требования к системе управления качеством, контролю качества исходного сырья, персоналу, помещениям и оборудованию, документации, производству продукции и проведению анализов по контрактам, рекламациям, порядку отзыва продукции и организации самоинспекций.

В основе концепции GMP лежит принципиально новый подход к обеспечению качества лекарственных средств, а именно: переход от контроля качества готовой продукции к обеспечению ее качества во время процесса производства. При этом объектом контроля в первую очередь становятся сам процесс производства и различные производственные факторы (здания, помещения, оборудование, персонал и т.д.), т.е. работа по стандартам GMP полагает самоинспекцию: ежедневный внутренний контроль способа производства и качества выпускаемой продукции на основе соответствующих нормативов и приборной базы. Без постоянного контроля нельзя поддерживать производство в соответствии с стандартами GMP.

Стандарты GMP базируются на необходимости устранения негативных моментов в производственном процессе, в результате учета тех факторов, которые могут нанести ущерб готовой продукции. Причина постоянно возрастающих требований к обеспечению качества при разработке, исследованиях, производстве и распространении лекарственных средств обусловлена тем, что качество неразрывно связано с безопасностью и
эффективностью препаратов и, следовательно, со здоровьем и безопасностью
каждого отдельного пациента и общества в целом.

Так как, наше государство динамично интегририруется в мировую систему, то и производственники вынуждены переходить на международные правила и принципы.

Каждое фармпроизводство имеет свои отличительные особенности. Это связано с выпускаемой номенклатурой лекарственных препаратов, особенностью проекта производства, Устава и Политики предприятия, его структуры, специфических особенностей выпускаемой продукции.

Подготовка к сертификации по стандартам GMP требует кропотливой работы всего коллектива предприятия. Основными факторами являются разработка и формирование документов производства. Для того, чтобы заведомо документы оформлялись качественно, необходимо проводить тренинги, обучать персонал.

В РГП «Научном центре противоинфекционных препаратов» идет активная работа по внедрению международных требовании GMP, на базе опытного производства разработаны такие методические рекомендации, как:

– Проведение валидационных процессов в производстве лекарственных средств по системе GMP;

-Совершенствование нормативной базы, видов и процессов производства лекарственных средств при внедрении систем GMP и GLP;

-Интеграция систем СТ РК ИСО 9001-2009, 13485:2003, ИСО/МЭК 17025-2007 в стандарты GMP, GLP, GСP, GDP, GРP;

-Разработка документов по стандартам GMP для производства лекарственных средств;

-Особенности складской зоны производства согласно требованиям GMP.

При составлении данных рекомендации, были учтены и отражены все позитивные моменты наработанные в научном центре. Кроме того, составлены СОПы, идут валидационные процессы, разрабатываются необходимые другие документы и т.д.

Разработанные рекомендации, которые можно использовать как вспомогательную литературу, доступны для всех желающих субъектов фармацевтического рынка.

Выпуск высококачественных лекарственных препаратов в условиях, соответствующих международным стандартам, является одной из важнейших задач здравоохранения Казахстана. От решения этой проблемы зависит не только степень обеспечения санитарно-эпидемиологической безопасности населения страны, но и здоровье нации в целом. Приоритетом в программе развития фармацевтической отрасли Казахстана на 2010-2014 годы является повышение конкурентоспособности отечественной фармацевтической промышленности путем гармонизации отечественных стандартов по разработке и производству лекарственных средств с международными требованиями, что предусматривает обязательный переход предприятий фармацевтической отрасли на международные стандарты.

 

Вопросы для самоконтроля:

1. Как антибиотики делятся по источникам выделения?

2. Какие механизмы биологического воздействия антибиотиков вы знаете?

3. Что такое антибиотикорезистентность?

4. В чем заключается сущность биотранформации стероидов и гормонов?

5. С чем связывают успехи производства стероидов?

6. Какие требования предъявляются к средам для ббиотранформации стероидов?

7. В чем заключается концепция GMP?

 

Тезисы лекции №5

Иммунобиотехнологии

Цель лекций –

 

Ключевые слова (термины) -

 

План лекции:

1. Перспективные направления современной иммунобиотехнологии. Гибридомная технология.
2. Моноклональные антитела. Использование антител для очистки биологических жидкостей. Возможности использования моноклональных антител при решении проблемы безопасности лекарственных средств (мониторинг лекарственных средств).
3. Типы вакцин и их конструирование. Культуральные и генноинженерные вакцины. Субъединичные вакцины. Современные вакцины. Современные способы и направления разработок. Пептидные вакцины на примере противоящурной вакцины. Аутовакцины. Липосомальные вакцины. Технологии совершенствования липосамальных вакцин.
4. Производство сывороток. Современные прививочные препараты. Иммуносенсоры. Производство иммуномодуляторов, иммуностимуляторов и иммунодепрессантов. Проблемы биобезопасности вакцинных препараторов.

1. Современная наука достигла такого этапа развития, когда для исследования необходимы реактивы, способные взаимодействовать с индивидуальными молекулами либо с различными участками макромолекул, что обеспечивает точность качественного и количественного анализа. Этим критериям идеально соответствуют молекулы иммуноглобулинов. Так как данные реагенты необходимы в большом количестве, перед исследователями была поставлена задача наладить производство антител одной специфичности (моноклональных) в промышленном масштабе. Было предпринято множество попыток, из которых следует отметить методики получения моноклональных антител из опухолей лимфоидных тканей и производства поликлональных антисывороток. Предложенные методы имели целый ряд недостатков и не удовлетворяли предъявляемым требованиям. Было невозможно получить опухоли, синтезирующие антитела на интересующие исследователя антигены, а поликлональные антисыворотки обладали перекрестной реактивностью и содержали низкое количество моноклональных антител. В связи с этим революционным достижением послужила разработка методики получения лимфоидных гибридом, позволяющая получать моноклональные антитела практически на любой антиген в необходимых количествах.

Лимфоидные гибридомы — это бессмертные клеточные клоны, продуцирующие антитела одной специфичности (моноклональные). Гибридомы получают посредством слияния раковой клетки лимфоидного ряда и «нормального» зрелого лимфоцита. От раковой клетки гибридома наследует способность к неограниченной пролиферации, а от «нормального» лимфоцита — способность синтезировать антитела. Гибридомы синтезируют на основе банка клеток-носителей (линий раковых клеток), клон лимфоцитов, в принципе, можно получить практически на любой интересующий антиген. На данный момент в мире существует более 50 тыс. гибридом. Получены гибридомы на основе клеток мышей, крыс, золотистого и китайского хомячков, клеток человека и т.д. Первоначально были получены гибридомы на основе клеток мыши линии balb/c, технология получения которых была разработана ранее. В настоящее время банк гибридом пополняется посредством получения гибридом на интересующие исследователей антигены. Гибридомная технология на данном этапе является единственной технологией, позволяющей получать моноклональные антитела в необходимом количестве, и занимает ведущее место в коммерческом обороте продуктов биотехнологии.

Технология лимфоидных гибридом была разработана в 1975 году Мильштейном и Келлером, и уже к 1977 году ими было получено 16 типов гибридом, синтезирующих различные типы моноклональных антител. Первоначально гибридомная технология строилась на основе следующих разработок: имелись линии миеломных клеток мышей balb/c (дефектные по некоторым ферментам метаболизма нуклеиновых кислот, что являлось необходимым условием для селекции получаемых гибридом), полученные в результате развития методов получения миелом, посредством введения инертного пластика и минеральных масел в виде подкожных инъекций мышам; разработаны методы слияния клеток с помощью вирусов (вирус Сендай) и полиэтиленгликоля; разработаны методики избирательной селекции клеток с помошью среды ГАТ. Главной заслугой Мильштейна и Келлера явилась непосредственно разработка методики, а также возможность использования получаемых гибридом для широкомасштабного производства моноклональных антител. Возможности гибридомной технологии были оценены по достоинству, и в 1984 году Келлер и Мильштейн были удостоены Нобелевской премии. В последующие годы были получены другие линии клеток-носителей, в том числе и линии клеток человека, однако наиболее распространенным типом гибридом являются гибридомы на основе мышиных клеток. Следует заметить, что, несмотря на огромную практическую значимость гибридомная технология решила и ряд теоретических затруднений, в частности это был окончательный и, вероятно, самый весомый довод в пользу клонально-селективной теории синтеза антител.

Гибридомная технология, в ее классическом варианте, выполняется в несколько этапов. В качестве предпосылок, необходимо иметь линию раковых клеток-носителей, дефектных по одному из ферментов (тимидинкиназе (ТК) или гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазе (ГГФРТ)), что само по себе определяет выбор способа селекции образующихся гибридом; разработанную процедуру слияния клеток; антиген, антитела на который необходимо получить исследователю, методики определения продуцируемых гибридомой антител с целью клонирования необходимой линии. При наличии всего вышеперечисленного процедура получения лимфоидных гибридом выглядит следующим образом (рис 1):

1. иммунизация животных выбранным антигеном и выделение «нормальных» лимфоцитов иммунизируемого животного после определения максимального титра интересующих исследователя антител;

2. культивирование раковых клеток-носителей;

3. проведение слияния клеток-носителей с «нормальными» лимфоцитами (в классическом варианте с помощью полиэтиленгликоля);

4. проведение процедуры селекции образующихся гибридом с помощью среды ГАТ. Клетки, имеющие дефект по одному из перечисленных ферментов (ТК или ГГФРТ), не способны расти в ГАТ среде, содержащей гипоксантин, тимидин и аминоптерин. Аминоптерин блокирует синтез dTMP посредством ингибирования дигидрофолят-редуктазы.

Клетки, имеющие дефект по одному из перечисленных ферментов (ТК или ГГФРТ), не способны расти в ГАТ среде, содержащей гипоксантин, тимидин и аминоптерин. Аминоптерин блокирует синтез dTMP посредством ингибирования дигидрофолят-редуктазы. Следовательно, в среде, содержащей аминоптерин, синтез пиримидинов может происходить только из готовых предшественников (из тимидина в данном случае). Клетки, содержащие дефектную ТК не способны расти в ГАТ среде. Клетки, содержащие дефектную ГГФРТ, способны синтезировать пурины из предшественников, но не из готовых продуктов (из гипоксантина в данном случае), следовательно, в ГАТ-среде данные клетки погибнут. В том случае, если произойдет слияние клеток таким образом, что у полученных гибридов дефектные ГГФРТ и ТК будут дополнены функциональными ферментами, то данные гибриды выживут в ГАТ-среде.

К таким клеткам относятся гибридные клетки, получившие оба фермента от родительских клеток (по одному от каждой). При слиянии миеломных клеток с лимфоцитами можно использовать опухолевые клетки, дефектные только по одному из ферментов, т.к. лимфоциты не способны размножаться в культуре и погибают через некоторое время естественным путем (полуселективный способ) (рис 2);

5. проведение процедуры культивирования полученных лимфоидных гибридом и выделение клона гибридом, продуцирующего необходимые антитела (выделение клона, продуцирующего нужные исследователю антитела необходимо, т. к. только в этом случае будет происходить наращивание концентрации гибридом данного типа);

6. проведение изучения полученных гибридом;

7. наращивание концентрации моноклональных антител in vivo (с помощью асцитных жидкостей) или in vitro.

Такова классическая схема получения лимфоидных гибридом, предложенная Келлером и Мильштейном. До настоящего момента основная схема существенным образом не изменилась. С учетом всех вышеперечисленных предпосылок данная методика принята во множестве лабораторий мира и вполне оправдывает себя. Изменения касаются некоторых пунктов и в основном являются результатом модификации существующей процедуры под нужды конкретной лаборатории. Следует отметить следующие изменения:

· Использование в качестве клеток-носителей других линий клеток, не имеющих дефект по вышеперечисленным ферментам, приводит к необходимости изменения процедуры селекции образующихся гибридом, т. к ГАТ-среда в данном случае не работает. Таким образом, разрабатываются методы селекции, подходящие для выбранных клеток. Примером такой модификации может служить метод «интерферон-вирус», разработанный для клеток человека J-96 и мышиных клеток L929;

· В связи с усовершенствованием методов электрослияния клеток происходит его активное внедрение в гибридомную технологию в качестве альтернативы слияния с помощью этиленгликоля, вытеснившего в свое время методику слияния с помощью вирусов (вирус Сендай);

· В качестве клеток-носителей все чаще начинают использование клеток других типов, полученных либо от организма одного вида, либо даже от разных видов. Разработка подобных методов позволяет не только изучить особенности функционирования клеток как таковых, но и имеет колоссальный практический интерес, т.к. позволяет решить проблему получения человеческих гибридом.

Одной из основных трудностей, возникающих при получении лимфоидных гибридом, является наличие феномена элиминации хромосом, заключающегося в потере определенных хромосом в процессе культивирования. Данный процесс может служить причиной потери клеткой признаков, необходимых исследователю, в частности, потери способности к неограниченной пролиферации у раковых клеток и способности к синтезу иммуноглобулинов у гибридом. В данном процессе имеется корреляция между количеством хромосом и степенью их элиминации. Чем больше хромосом в клетке, тем меньше вероятность потери необходимых исследователю свойств. Следует заметить, что элиминация хромосом — процесс «направленный». Элиминации подвержены в большей мере те хромосомы, наличие которых не является необходимым клетке для выживания в данных условиях культивирования. Следовательно, изменяя условия культивирования, можно в некоторой степени направлять процесс элиминации в нужную сторону.

Для получения линии клеток-носителей необходимо следующее условие: клетки должны обладать способностью к неограниченной пролиферации и не продуцировать собственных антител (в случае, если подобные клетки являются клетками лимфоидного ряда). Этого можно достичь посредством отбора интересующего клона клеток в процессе их культивирования с целью сохранения необходимых признаков (вышеперечисленных в данном случае). Это осуществляется вследствие повышенной мутабельности раковых клеток.

При получении лимфоидных гибридом существует опасность потери способности образующейся гибридомы к синтезу антител. Этого можно избежать путем подбора соответствующей линии клеток-носителей и оптимальных условий культивирования гибридом. этот феномен также связан с феноменом элиминации хромосом и имеет те же ограничения, что и описанные выше.

Гибридомная технология позволяет получать практически неограниченное количество моноклональных антител практически на любой существующий антиген. Эта методика по своим масштабам не имеет конкуренции и является лидером по коммерческому обороту. Так как каждая гибридома может продуцировать только один вид антител, является целесообразным разработка новых типов гибридом, основанных на клетках других организмов, что позволит не только получать моноклональные антитела, идеально подходящие для работы с данными видами, но и изучить особенности функционирования клеток последних, рассмотреть вопросы, касающиеся биосинтеза антител et cetera. В связи с этим, перспективным является получение лимфоидных гибридом на основе клеток кур. Клетки кур имеют ряд преимуществ по сравнению с клетками других видов животных по ряду признаков:

· наличие большого числа минихромосом дает возможность избежать элиминации необходимых исследователю признаков, как было описано выше;

· наличие особенностей иммуногенетики кур (особенности адаптации синтеза антител к структуре антигена при более «простой» в отличие от млекопитающих структуры генов, кодирующих антитела).

Получение лимфоидных гибридом на основе линии клеток кур позволит получать моноклональные антитела в необходимом количестве, а также изучить ряд теоретических задач, касающихся проблем иммуногенетики кур et cetera. В качестве клеток-носителей будет использоваться линия трансформированных лимфоидных клеток кур. Структура получения гибридом на основе клеток кур такова:

1. Получение суспензии клеток костного мозга суточных цыплят;

2. Выделение из суспензии лимфоидных клеток посредством центрифугирования в градиенте плотности фиколла;

3. Культивирование лимфоидных клеток в полужидких агаровых средах;

4. Трансформация лимфоидных клеток с помощью химических канцерогенов;

5. Клонирование трансформированных лимфоидных клеток;

6. Иммунизация кур выбранным антигеном;

7. Определение титра антител и выделение лимфоцитов при его максимальном значении;

8. Проведение электрослияния трансформированных лимфоидных клеток с «нормальными» лимфоцитами;

9. Клонирование полученных гибридом.

Проведение индивидуального электрослияния клеток позволяет избежать процедуры селекции образующихся гибридом, т.к. в данном случае отбор будет производиться непосредственно во время слияния клеток. Таким образом, получение лимфоидных гибридом на основе линии трансформированных лимфоидных клеток кур позволит получить новый тип гибридом, синтезирующих моноклональные антитела на интересующий антиген с перспективой их использования в самых различных областях — от создания диагностических наборов до использования в самых разных областях ветеринарии и сельского хозяйства.

 

2. Моноклональные антитела (МАТ) – это антитела, произведенные в лабораторных условиях, которые имеют способность связываться с конкретными антигенами раковых клеток.

Например, белок, присутствующий на поверхности клеток рака, в здоровых клетках он не наблюдается или находится в минимальном количестве.

Для создания моноклональных антител экспериментаторы вводят их грызунам с антигеном из человеческих раковых клеток. После этого они берут клетки, производящие антитела от животных и индивидуально соединяют их с раковой миеломной клеткой. Таким образом, получаются слитые клетки, известные под названием гибридомы.

Каждая отдельная гибридома (клеточная линия) путем деления далее производит дочерние идентичные клетки или клоны, которые и получили название «моноклональные».

Антитела, выдаваемые различными клонами, проходят проверку на способность идентифицировать такие антитела, которые намного теснее связаны с антигеном. При помощи этих гибридных бессмертных клеток можно получить большие количества антител.

Ввиду того, что мышиные антитела способны самостоятельно вызывать у людей иммунный ответ, который может снизить их эффективность, антитела мышей зачастую «очеловечивают» методом замены большей части родного антитела (человеческими порциями, насколько это возможно). Этот путь проделывается при помощи генной инженерии.

Ввиду того, что мышиные антитела способны самостоятельно вызывать у людей иммунный ответ, который может снизить их эффективность, антитела мышей зачастую «очеловечивают» методом замены большей части родного антитела (человеческими порциями, насколько это возможно). Этот путь проделывается при помощи генной инженерии.

Каждая группа моноклональных антител работает по-своему. Некоторые препараты стимулируют иммунный ответ, разрушающий раковые клетки. Эти моноклональные антитела, равно как и антитела, полученные физиологическим путем работы В-клеток, покрывают поверхность раковой клетки оболочкой, тем самым вызывая разрушение ее иммунной системой.

Медициной уже одобрены моноклональные антитела этого типа. Например, ритуксимаб – препарат ориентирован на антиген CD20, обнаруженный в клетках неходжкинской лимфомы, или алемтузумаб, ориентированный на антиген CD52, который был найден в клетках ХЛЛ (хронического лимфолейкоза).

Ритуксимаб способен непосредственно являться причиной гибели клеток (апоптоз). Другая группа препаратов моноклональных антител, связываясь с рецепторами находящимися на поверхности клеток иммунной системы, стимулирует противоопухолевый иммунный ответ и уменьшает сигналы, мешающие иммунным клеткам нападать на ткани собственного организма, в число которых входят и раковые клетки.

Ипилимумаб, относящийся к группе подобных препаратов, был создан сравнительно недавно в 2011 году для лечения метастатической меланомы. Существуют и другие аналогичные лекарства, но они еще находятся в стадии клинических исследований.

Антитела мешают деятельности белков (VEGF), необходимых для роста раковой опухоли. Например, действие препарата бевацизумаб направлено на эндотелиальный сосудистый фактор роста белка, выделяемого опухолевыми и другими клетками, находящимися в микроокружении опухоли (это способствует разветвлению кровеносных сосудов, питающих злокачественную опухоль).

В тот момент, когда бевацизумаб связывается с VEGF, белок теряет способность взаимодействовать с клеточными рецепторами, что предотвращает рост новых кровеносных сосудов.

По такой же аналогии действуют препараты панитумумаб и цетуксимаб. В данном случае целевым выступает EGFR (рецептор эпидермального фактора и роста), а моноклональные антитела трастузумаб настроены на HER-2 (человеческий рецептор эпидермального фактора роста 2).

МАТ, связывающиеся с клеточной основой фактора роста рецепторов, мешают рецептору отправлять свои нормальные, вызывающие рост, сигналы. Кроме того они могут активизировать иммунную систему и запускать апоптоз для уничтожения опухолевых клеток.

К другой группе противоопухолевых терапевтических моноклональных антител относятся иммуноконъюгаты. Их иногда называют антитела конъюгаты или иммунотоксины – эти препараты объединяют в своем составе:

· химиотерапевтические препараты;

· бактериальные токсины;

· радиоактивные молекулы, прикрепленные к веществу клеток киллеров.

Прикрепляется антитело на поверхности раковой клетки к своему специфическому антигену, и в ту же минуту действующее вещество начинает растворять раковые клетки. Работающие таким образом и утвержденные иммуноконъюгаты – это, прежде всего:

1. ибритумомаб тиуксетан, действие которого направлено на антиген CD20. Препарат ориентирован на доставку радиоактивного иттрия-90 к В-клеткам, что необходимо для устранения неходжкинской лимфомы;

2. шума-трастузумаб эмтансин, ориентированный на молекулу HER-2. МАТ нужен для доставки препарата DM1, ингибитора пролиферации клеток. HER-2 относится к метастатическим клеткам онкологии молочной железы;

3. тозитумомаб, ориентированный на антиген CD20 для доставки радиоактивного йода-131 к клеткам неходжкинской лимфомы.