Простые и сложные методы окраски

Простой метод окраски. Является одноэтапным и заключается в окраске микропрепарата одним красителем. Используют основные анилиновые красители, такие как, фуксин, генцианвиолет, метиленовый синий в виде водных растворов или пропитанных красителем фильтровальных бумажек, которые помещают на мазок и смачивают водой. Продолжительность окраски составляет 1-5 минут, после чего микропрепарат промывают водой, высушивают и микроскопируют. В препаратах, окрашенных простым методом, можно получить представление о форме, расположении и размерах микробных клеток.

Сложные методы окраски. Сложные (дифференцирующие) методы окраски (по Граму, Цилю-Нильсену и др.) включают последовательное использование нескольких красителей и дополнительных способов обработки препаратов. Эти методы позволяют дифференцировать бактерии в зависимости от строения их структур, чаще всего поверхностных. Например, метод окраски по Граму позволяет дифференцировать бактерии по строению их клеточной стенки: грамположительные (фиолетовые) бактерии с толстой клеточной стенкой и грамотрицательные (красные) бактерии с тонкой клеточной стенкой.

Существуют специальные сложные методы окраски, которые используют для выявления структурных компонентов бактериальной клетки: капсул, цитоплазматических включений, спор, жгутиков.

Механизмы окрасок по Граму и Цилю-Нильсену

Метод Грама. Относится к сложным методам окраски и позволяет дифференцировать грамположительные и грамотрицательные бактерии, что является важным таксономическим признаком. Результат окраски определяется особенностями строения клеточной стенки бактерий. При окраске генцианвиолетом и последующем воздействии раствора Люголя образуется комплексное соединение генцианвиолета и йода с пептидогликаном, которое при обработке спиртом удерживается в клетках грамположительных бактерий, имеющий многослойный пептидогликан и вымывается из грамотрицательных бактерий, имеющих тонкий слой пептидогликана. При дополнительной окраске водным раствором фуксина грамотрицательные бактерии приобретают красный цвет.

 

Таблица 4. Метод Грама

Этапы окраски	Цвет бактерий
1. На фиксированный мазок поместить фильтровальную бумажку, пропитанную генцианвиолетом, смочить водой, 2-3 минуты	Все бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет
2. Снять бумажку, слить с препарата оставшуюся краску и налить раствор Люголя на 1 минуту	Все бактерии остаются фиолетовыми
3. Для дифференцирования нанести на мазок этиловый спирт в течение 3-6 с, промыть водой	Грамположительные бактерии остаются фиолетовыми, грамотрицательные обесцвечиваются
4. Нанести фуксин Пффейфера (водный раствор фуксина) на 1-2 мин, промыть водой, высушить	Грамположительные остаются фиолетовыми, грамотрицательные окрашиваются в красный цвет

Метод Циля-Нильсена. Относится к сложным методам окраски и позволяет дифференцировать кислотоустойчивые и некислотоустойчивые бактерии.

Таблица 5. Метод Циля-Нильсена

Этапы окраски	Цвет бактерий
1. На фиксированный мазок нанести карболовый раствор фуксина Циля через полоску фильтровальной бумаги и подогреть препарат в пламени горелки до появления паров (повторить 3-4 раза)	Все бактерии окрашиваются в красный цвет
2. Снять бумагу, промыть мазок водой	Все бактерии остаются красными
3. Для дифференцирования нанести 5% раствор серной кислоты на 1-2 минуты	Кислотоустойчивые бактерии остаются красными, некислотоустойчивые обесцвечиваются
4. Нанести водный раствор метиленового синего и докрасить 3-5 мин, промыть водой, высушить	Кислотоустойчивые остаются красными, некислотоустойчивые окрашиваются в синий цвет

Кислотоустойчивые бактерии имеют особое строение клеточной стенки, содержащей большое количество сложных липидов (миколовая и фтиоловая кислоты, воск D, глико- и фосфолипиды), что делает эти бактерии кислото-, щелоче- и спиртоустойчивыми. Клеточная стенка этих бактерий плохо воспринимает анилиновые красители и обычные способы окраски. Высокая температура в процессе окраски методом Циля-Нильсена расплавляет липиды, фенол разрыхляет клеточную стенку и краситель проникает внутрь клетки. После остывания препарата липиды вновь затвердевают, прочно удерживая краситель, поэтому кислотоустойчивые бактерии не обесцвечиваются серной кислотой и остаются красными. Некислотоустойчивые бактерии обесцвечиваются и их докрашивают контрастным красителем — метиленовым синим. В основном, метод используется для окраски бактерий, относящихся к роду Mycobacterium (M.tuberculosis, M.bovis, M.leprae и др.)

III. План практической работы

1. Изучить механизм и этапы окраски по Граму, приготовить мазок из смеси бактерий и окрасить по Граму, заполнить таблицу в рабочей тетради.

2. Изучить механизм и этапы окраски по Цилю-Нильсену, приготовить мазок из сапрофитных микобактерий, окрасить по Цилю-Нильсену, заполнить таблицу в рабочей тетради.

3. Сравнить строение прокариотической и эукариотической клетки по ряду признаков, заполнить таблицу в рабочей тетради.

4. Изучить и перечислить в таблице основные таксономические категории на примере C.tetani и T.pallidum или других бактерий.

IV. Примеры ситуационных задач

Ситуационная задача № 1

Из мокроты больного приготовлен мазок и окрашен по методу Циля-Нильсена. При микроскопии с масляной иммерсией обнаружены длинные палочки, располагающиеся одиночно и окрашенные в красный цвет. Сформулируйте заключение микроскопического исследования:

1. В исследуемом материале обнаружены микроорганизмы рода Mycobacterium

2. В исследуемом материале обнаружены микроорганизмы Staphylococcus

3. В исследуемом материале обнаружены микроорганизмы Streptococcus

4. В исследуемом материале обнаружены микроорганизмы семейства Enterobacteriaceae

Ситуационная задача № 2

Из гноя больного приготовлен мазок и окрашен по методу Грама. При микроскопии с масляной иммерсией обнаружены кокки (шаровидные бактерии), располагающиеся в виде гроздьев винограда и окрашенные в фиолетовый цвет. Сформулируйте заключение микроскопического исследования:

1. В исследуемом материале обнаружены микроорганизмы рода Mycobacterium

2. В исследуемом материале обнаружены микроорганизмы рода Staphylococcus

3. В исследуемом материале обнаружены микроорганизмы рода Streptococcus

4. В исследуемом материале обнаружены микроорганизмы семейства Enterobacteriaceae

Ситуационная задача № 3

Из фекалий больного приготовлен мазок и окрашен по методу Грама. При микроскопии с иммерсией обнаружены одиночные палочки, окрашенные в красный цвет. Сформулируйте заключение микроскопического исследования:

1. В исследуемом материале обнаружены микроорганизмы рода Mycobacterium

2. В исследуемом материале обнаружены микроорганизмы рода Staphylococcus

3. В исследуемом материале обнаружены микроорганизмы рода Streptococcus

4. В исследуемом материале обнаружены микроорганизмы семейства Enterobacteriaceae