Тема: Возбудители микотоксикозов

Цель: Ознакомить студентов с правилами взятия материала для исследования и лабораторной диагностики микотоксикозов.

Задание:

1. Из культур грибов приготовить препараты «раздавленная капля».

2. Изучить под микроскопом.

3. Зарисовать морфологию грибов в тетради.

Материалы и оборудование: Культуры грибов родов Stachybotrys, Fusarium, Dendrodochium на агаре Чапека в чашках Петри; препаровальные иглы или микологи­ческие крючки, предметные и покровные стекла; таблицы и плакаты по данной теме.

Микотоксикозы — отравления животных, возникающие при поедании кор­мов содержащих токсические продукты жизнедеятельности грибов (микотоксины). К микотоксинам чувствительны почти все виды домашних (наиболее - лошади, свиньи, овцы), диких животных, птицы и рыбы. Наименование микотоксикоза происходит от названия токсина или гриба-продуцента токсина. При диагностике этих болезней наибольшее вни­мание уделяют обнаружению токсина, поскольку гриб-продуцент в ряде случаев к моменту исследования погибает и, кроме того, один и тот же микотоксин может синтезировать различные виды грибов. Путь инфицирования - алиментарный.

Основные возбудители грибы видов: Stachybotrys alternans, Dendrochium toxicum, Fusarium sporotrichioides, Claviceps paspali, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigates, Penicillium rubrum, Claviceps purpure и др.

Лабораторная диагностика микотоксикозов включает токсико-биологические, микологические и физико-химические исследования.

Материалом для исследования на микотоксикозы служат пробы всех кор­мов, входивших в суточный рацион животного в течение одного месяца до прояв­ления болезни, а также остатки кормов из кормушек, содержимое желудочно-кишечного тракта павших животных. Отбор средних проб корма проводят вете­ринарные и зооинженерные специалисты с представителями предприятий. Ото­бранную среднюю пробу делят на две части, упаковывают в чистые сухие стек­лянные банки емкостью 2—3 л, герметически закрывают и пломбируют. Одну часть отправляют в лабораторию, другую — хранят в хозяйстве в течение одного месяца в условиях, предотвращающих порчу или вторичное загрязнение. В доку­менте указывают цель исследования, вид кормового средства, назначение, массу всей партии корма, место отбора пробы, основные клинические признаки у боль­ных животных. Прилагают копию акта вскрытия трупов (при гибели животных), копию экспертиз ветеринарной лаборатории об исключении инфекционных бо­лезней и отравлений животных химическими или растительными ядами (если та­кие исследования были проделаны лабораторией).

При токсико-биологическом исследовании определяют токсичность корма на различных биологических моделях: кроликах, аквариумных рыбах группы по­роды Винер, белых мышах или сельскохозяйственных животных. На кроликах ставят кожную пробу. К 50 г измельченного корма добавляют 150 мл диэтилового эфира (эфир для наркоза) или ацетона. Смесь встряхивают при комнатной температуре с помощью шуттель-аппарата

3 часа. Эксгракт фильтруют и выпаривают до полного исчезновения запаха. Налет, оставшийся на стенках чашки, смывают небольшим количеством эфира и использу­ют для биопробы. Биологическую пробу проводят на кроликах массой 2—2,5 кг. Предварительно у кролики в области бедра, лопатки или бока выстригают участок кожи 6x6 см. Пигментированная или с признаками шелушения кожа непригодна для исследования. На одном кролике можно ставить не более 4 проб. На выстриженный участок кожи кролика наносят стеклянной лопаткой половину экстракта и легко втирают его. При восковидной консистенции экстракта его предварительно подог­ревают. Часть участка оставляют свободной от экстракта как контрольную. Через 24 часа наносят оставшийся экстракт. Чтобы предупредить слизывание его, кролику надевают воротник (не менее чем на 3 дня). Учет проводят на следующий день по­сле повторного нанесения экстракта и продолжают вести наблюдение в течение 3— 5 дней в зависимости от реакции, после чего дают окончательную оценку: корм не­токсичный — отсутствуют воспалительная реакция и изменения на коже; корм сла­ботоксичный — шелушение кожи, отечность, болезненность, незначительное утол­щение кожи с образованием отдельных корочек; корм токсичный— резкая гипере­мия, отек, утолщение кожи, болезненность, появление язвы и струпа.

В качестве дополнительного теста используют метод определения токсич­ности кормов на аквариумных рыбах. Методика основана на извлечении микотоксинов из фуражного зерна, продуктов его переработки и комбикормов, экстрак­ции хлороформом и исследовании на рыбках — гуппи. В раствор экстракта по­мещают 5 рыбок независимо от пола и возраста. Ведут наблюдения в течение 24—30 часов. Оценка степени токсичности корма: нетоксичный — при гибели не более одной рыбки в течение 24 часов; слаботоксичный — при гибели 2—4 ры­бок; токсичный — при гибели всех 5 гуппи за тот же отрезок времени.

Определение токсичности корма на белых мышах. Методика основана на извлечении токсических веществ из жмыхов, кормовых дрожжей ацетоном и вве­дении концентрированного экстракта однократно в желудок белым мышам мас­сой 20—25 г. Наблюдают животных 3 суток, не ограничивая их в кормлении и поении. Оценка результатов корма: нетоксичный — мыши живы, на вскрытии у убитых мышей патологоанатомических изменений нет; слаботоксичный — мыши живы, при вскрытии у убитых обнаруживают геморрагическое воспаление желу­дочно-кишечного тракта, чаще очаговое; токсичный— гибнут все мыши (или од­на), на вскрытии павших или убитых устанавливают геморрагическое воспаление желудочно-кишечного тракта, часто дегенерацию тканей печени, почек или кро­воизлияние в паренхиматозных органах. Если токсичность корма не выявлена все­ми перечисленными методами, применяют скармливание подозрительных кормов лабораторным животным (цыплятам, утятам, голубям, белым мышам, морским свинкам, кроликам) или тем видам животных, которые болели в хозяйстве.

Микологический анализ включает выделение и идентификацию грибов-продуцентов микотоксинов из кормов. С этой целью из кормов делают посевы в чашки Петри с агаром Чапека, сусло-агаром или в жидкую среду Билай. Грубые корма высевают во влажные камеры со средой Ван-Итерсона. Перед посевом агар расплавляют в водяной бане, после охлаждения до +45—50 °С в него для подав­ления роста сопутствующей микрофлоры добавляют антибиотики (пенициллин 50 тыс. ЕД и стрептомицин 100 тыс. ЕД на 1 л среды). Для приготовления влажной камеры со средой Ван-Итерсона на дно чашки Петри кладут тонкий слой ваты с полоской фильтровальной бумаги по диаметру чашки и стерилизуют в сушильном шкафу) Перед посевом на фильтровальную бумагу наливают среду Ван-Итерсона увлажнения бумаги, не создавая избытка влаги (около 5 мл). Для выделения грибов из зерен последние раскладывают по поверхности фильтровальной бумаги по 10 штук, чтобы они не соприкасались одно с другим. Посевы культивируют при +22—25⁰С 3—10 дней до образования характерного спороношения, после чего проводят макро- и микроскопическое исследование культур грибов с целью идентификации. При макроскопическом исследовании учитывают различные признаки выросших колоний: цвет, форму, консистенцию, характер роста, наличие склероциев, пигмента, степень развития воздушного ми­целия. Затем готовят препараты раздавленной капли. Микологическим крючком или препаровальной иглой берут частицы мицелия (желательно со спороношением из молодых культур с периферии, от старых — из центра колоний) и вносят их в фиксирующую жидкость. Другой иглой материал расправляют на предметном стекле и покрывают покровным стеклом, слегка прижимая его. Микроскопируют с помощью малого объектива (Х8, Х40) или иммерсии при слегка опущенном кон­денсоре. Токсичность культур определяют методом кожной пробы на кроликах или другим способом.

Физико-химический анализ проводят с целью качественного и количествен­ного определения микотоксинов в кормах и других материалах (люминесцентный метод, хроматография и т. д.).

Возбудитель стахиботриотоксикоза — сапрофитный гриб Stachybotrys alternans, относится к высшим несовершенным грибам класса Deuteromycetes, рода Stachybotrus. Активный разрушитель целлюлозы (соломы, сена, зерна и др.), обра­зует токсин — стахиботриотоксин, который относится к группе трихотеценов. Ток­син образуется постепенно в стеригмах, конидиях, конидиеносцах и накапливается в субстрате. Он устойчив к нагреванию, даже к автоклавироваиию, но ин активиру­ется под действием щелочей и хлора. К стахиботриотоксину чувствительны лоша­ди, крупный рогатый скот, овцы, птицы, свиньи — отравление наступает при по­едании животными токсического корма. Болезнь характеризуется некрозом слизи­стых оболочек, нарушением иммунной и нервной систем, изменениями в крове­творных органах, тяжелыми расстройствами желудочно-кишечного тракта.

Кулътуралъно-морфологические свойства. S. alternans — аэроб, оптималь­ная температура +24—26 °С. рН 6,8—7,0, влажность 45—50 %. При влажности 20 % не растет. Гриб хорошо развивается на естественных субстратах и на ис­кусственных питательных средах: Ван-Итерсона, на агаре Чапека или сусло-агаре. В чашках Петри на фильтровальной бумаге, смоченной средой Ван-Итерсоиа, S. alternans образует колонии от темно-серого до черного цвета. На агаре Чапека гриб образует округлые колонии с двумя зонами. Центральная зона складчатая, черного цвета, периферия имеет белую прозрачную каемку. Цвет питательной среды вокруг колоний бурый, нередко с темно-вишневым оттенком. На сусло-агаре S. alternans образует черные колонии с бороздками, радиально расходящи­мися от центра. Цвет мицелия в молодой культуре бледно-оливковый, с возрастом становится оливково-бурым. Конидиеносцы также изменяются в зависимости от воз­раста и могут быть простыми и разветвленными с редкими перегородками. На верхушке конидиеносца можно наблюдать сросшиеся у основания яйцевидные стеригмы, называемые мутовками. На вершине стеригм образуются одноклеточ­ные округлые конидии. В молодой культуре они гладкие, бледно-оливкового цве­та. Зрелые конидии отличаются шиповидно-бородавчатой формой, непрозрачно­стью и черным цветом. Каждая стеригма образует по 3—7 конидий. Они склеи­ваются слизью и образуют головку на пучке стеригм.

Контрольные вопросы:

1. Основные отличия микозов и микотоксикозов.

2. Возбудители микотоксикозов, их морфологические, культуральные свойства.

3. Материал и порядок его исследования при микотоксикозах.

4. Методы определения токсичности грибов.

5. Основные питательные среды для культивирования грибов при диагностике микозов и микотоксикозов.