Типизация вируса ящура в РСК

При вирусных заболеваниях РСК ставят по общепринятой методике с учетом ряда особенностей. В реакции участвует две системы: специфическая (испытуемый антиген + спе­цифическая сыворотка) и индикаторная (гемолитическая сыворотка + взвесь эритроцитов барана).

Связывающим компонентом между ними является комплемент. Результаты будут за­висеть от того, в какой системе принимает участие комплемент. Если испытуемый антиген гомологичен антителам, находящимся в специфической сыворотке, то образуется комплекс антиген + антитело, связывающий весь комплемент. При отсутствии комплемента в индика­торной системе изменений не наступит (задержка гемолиза). Если антиген не соответствует антителам, в этом случае комплемент остается свободным, так как комплекс не образуется. При наличии свободного комплемента в индикаторной системе наступит гемолиз эритроци­тов.

Компоненты РСК

1. Гемолизин (гемолитическая сыворотка крови кроликов, содержащая антитела-гемолизины, вызывающие вместе с комплементом гемолиз эритроцитов барана),

2. Эритроциты барана (2 %-ная взвесь отмытых эритроцитов барана на физиологи­ческом растворе).

3. Комплемент (сухая или нативная сыворотка крови морских свинок)

4. Испытуемый антиген (инактивированная вирусосодержащая суспензия из афтозного
материала).

5. Контрольные стандартные антигены основных типов и вариантов.

6. Стандартные типоспецифические сыворотки.

7. Физиологический раствор.

Если РСК ставят в объеме 1 мл, то каждый компонент берут в количестве 0,2 мл, ес­ли в объеме 0,5 мл - по 0,1 мл. При постановке РСК микрометодом с помощью аппарата Такачи или титротек, объем каждого компонента составляет 0,025 мл.

Последовательность постановки РСК:

1 Титрация гемолизина

2 Подготовка гемсистемы.

3 Титрация комплемента.

4 Разведение стандартных типоспецифических ящурных сывороток и антигенов до рабочих титров.

5 Разлив стандартных сывороток, антигенов и физраствора по 0,2мл.

6 Разлив комплемента по 0,2 мл в рабочем титре.

7 Водяная баня 20 мин. при 37°С.

8 Разлив гемсистемы по 0,4 мл.

9 Водяная баня 30 мин. при 37°С.

10 Учет результатов после бани.

11 Учет результатов через 14-15 часов.

Титрование гемолизина

Титр гемолизина - наименьшее его количество, необходимое для полного гемолиза соответствующего объема 2 %-ной взвеси эритроцитов барана в присутствии комплемента, разведенного 1:20.

В РСК используют биофабричный гемолизин, консервированный глицерином 1:1. Поэтому для приготовления основного разведения 1:100 берут 0,2 мл гемолизина и 9,8 мл физраствора. Чтобы приготовить разведение 1:1000, берут 1 мл гемолизина, разведенного 1:100, и 9 мл физраствора. Затем необходимые разведения гемолизина готовят по схеме.

 

 

Компоненты	Разведение гемолизина
1:1500	1:2000	1:3000	1:4000	1:5000	1:6000	1:7000
Гемолизин 1:1000 (мл)	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
Физиологический раствор (мл)	0,5	1,0	2,0	3,0	4,0	5,0	6,0

 

Полученные разведения гемолизина по 0,5 мл используют при определении его титра.

Схема титрования гемолизина

 

Компоненты	Разведение гемолизина
1:1000	1:1500	1:2000	1 3000	1-4000	1:5000	1:6000
Гемолизин	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Физ. раствор	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
Комплемент 1:20	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Эритроциты
(2% взвесь)	0,5	0,5	0.5	0,5	0,5	0,5	0,5
Водяная баня 10 мин, при 37°С
Учет	-	-	-	-	++	+++

Согласно схеме, титр гемолизина составляет его разведение 1:3000, но в главный опыт берут гемолизин в четырехкратной концентрации, т. е. разведение 1:750, а так как он консервирован глицерином (1:1), то для приготовления рабочего раствора берут двойную дозу 2:750 или 0,2 мл цельного гемолизина и 74,8 мл физиологического раствора.

При титровании гемолизина и комплемента ставят следующие контроли:

1 Контроль эритроцитов (0,5 мл 2 %-ной взвеси эритроцитов + 2 мл физраствора).

2 Контроль гемолизина (0.5 мл 1:1000 гемолизина -I- 0,5 мл 2 %-ной взвеси эритроцитов + 1,5 мл физраствора).

3 Контроль комплемента (0,5 мл 1:20 комплемента + 0.5 мл 2 %-ной взвеси эритроцитов + 1,5мл физраствора).

4 Контроль гемсистемы (0,5 мл 1:1000 гемолизина + 0,5 мл 1:20 комплемента + 1,0 мл физраствора).

В первых трех контролях должна быть задержка в последнем - гемолиз.

Приготовление гемолитической системы

Дефибрированные эритроциты барана отмывают физиологическим раствором с помощью центрифуги. Из осадка готовят 2%-ную взвесь на физиологическом растворе, которую размешивают в равном объеме с гемолизином в рабочем титре. Перед использованием гемоли­тическую систему выдерживают в термостате при 37°С 30 мин.

Титрование комплемента

Комплемент титруют в гомологической системе в день постановки реакции.

За титр комплемента принимают наименьшее его количество, необходимое для гемолиза соответствующего объема 2%-ной взвеси эритроцитов барана в присутствии гемолизина в рабочем титре.