Тема: Возбудитель бруцеллеза

Цель занятия: Ознакомить студентов с правилами отбора проб материала от жи­вотных, его упаковки и пересылки в лабораторию, а также с методами бактерио­логических и серологических исследований материала на бруцеллез.

Задание:

1. Приготовить мазки из патологического материала;

2. Окрасить по Грамму;

3. Окрасить по Козловскому;

4. Просмотреть под микроскопом, микрокартину зарисовать в тетради;

5. Поставить розбенгал-пробу;

6. Поставить кольцевую реакцию с молоком.

Материалы и оборудование: Растворы красителей для окраски по методу Козлов­ского, сыворотки крупного рогатого скота — позитивная (бруцеллезная) и нор­мальная в пробирках по 1 мл и те же сыворотки под разными номерами (шифра­ми) — испытуемые, бруцеллезный антиген для розбенгал-пробы и антиген бру­целлезный для кольцевой пробы с молоком; молоко коровье, свежее — отдельно пробирки с молоком от здоровых животных и пробирки с молоком от коров, больных бруцеллезом (содержащие антитела), по 2 мл в каждой; пробирки соот­ветственно помечены № 1 и 2; пипетки градуированные стерильные емкостью 1 и 0,1 мл (количество пипеток в зависимости от количества студентов в группе); пластины с луночками для постановки розбенгал-пробы, пробирки со взвесью бруцелл (антиген) и в смеси с бактериями других видов в физрастворе (сальмо­неллы или мезентерикус), вакцинный штамм микроба сибирской язвы и пробирки по 10 мл с физраствором. Для демонстрации необходимы таблицы (морфология бруцелл); пробирки с агаровой культурой бруцелл, залитые парафином (вак­цинный штамм); микроскопические препараты — мазки, окрашенные по методу Козловского и по Граму; в мазках — бруцеллы в смеси с другими бактериями; пробирки с положительной и отрицательной кольцевой реакцией с молоком; био­препараты.

Классификация:

Отдел – Gracilicutes;

Секция – 4, грамотрицательные аэробные палочки и кокки.

Порядок – Eubacteriales;

Семейство – Brucellaceae;

Род – Brucella;

Виды – Br. melitensis (выделен от коз и овец), Br. abortus (выделен от крупного рогатого

скота), Br.suis (свиной), Br. ovis (бараний вид), Br. canis (собачий) и Br. neotoma

(кустарниковых крыс).

Бруцеллы — микроорганизмы, вызывающие инфекционную, хронически протекающую болезнь животных (и человека) — бруцеллез. Наибольшее значение в патологии бруцеллеза животных и человека имеют бруцеллы первых трех видов. Бруцеллез жи­вотных преимущественно протекает бессимптомно. Диагностика этой болезни основывается на показаниях результатов серологических, бактериологических, а также аллергических методов исследования с учетом клинических признаков болезни — аборты, бурситы, орхиты, эпидидимиты, эндометриты.

Патологический материал. Для бактериологического исследования на бруцеллез (при жизни животного) в лабораторию направляют: абортированный плод с плодными оболочками, околоплодную жидкость, истечения из родовых путей, желудок плода, перевязанный с двух концов лигатурой, кусочки печени и селезенки плода. Молоко берут от коров в стерильные пробирки по 10—15 мл из каждой доли вымени (последние порции), у овец и коз — путем пункции цистер­ны вымени посредством стерильного шприца с иглой. Для исследования молоко отсылают свежим (в день взятия пробы); если это не представляется возможным, то его консервируют (лучше сухой борной кислотой из расчета 0,1 г на 10 мл мо­лока). При убое самцов (баранов и др.) исследуют пораженные ткани органов — семенники с придатками.

Бактериологическая диагностика бруцеллеза проводится по общеприня­тому принципу — микроскопия, высев на питательные среды для выделения и изучения чистой культуры, биопроба (заражение морских свинок).

Микроскопия. Из каждой пробы патматериала готовят два мазка-отпечатка из тканей органов или два мазка из жидкого материала (истечения), высушивают, фиксируют над пламенем. Один препарат окрашивают по Граму, другой — спе­циальным методом (по Козловскому; Шуляку — Шину или Стампу). Мазки, при­готовленные из осадка молока (сливок), после центрифугирования перед окрас­кой следует обезжирить смесью Никифорова. Бруцеллы — мелкие, палочко- или кокковидной формы бактерии, длиной 0,6—1,5 мкм, в диаметре — 0,3—0,5 мкм; неподвижные, спор не образуют, рас­полагаются в мазке изолированно, попарно или небольшими скоплениями, куч­ками.

Грамотрицательные.

Окраска по методу Козловского. Фиксированные препараты окрашивают свежеприготовленным 2 %-ным водным раствором сафранина при подогревании до появления паров (2 минут). Мазок быстро промывают водой и докрашивают 1 %-ным водным раствором малахитовой зелени в течение 1 минут, затем его про­мывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют: бру­целлы — красные, остальные микробы — зеленые.

Культуралъные свойства. Для выделения бруцелл делают посевы на специальные питательные среды: мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ), печеночно-глюкозно-глицериновый агар и бульон (ПГГА, ПГГБ), картофельный агар, эритрит-агар или сывороточно-декстрозный агар и др.

Посев исследуемого материала в жидкие и на плот­ные питательные среды проводят пастеровской пипеткой в несколько пробирок или чашек Петри. При исследовании молока полагается предварительно его центрифуги­ровать (300 об/мин 30 минут). Затем осадок высевают на агаровую среду в чашках Петри, содержащую бактериостатическое вещество, например в среду Козловского (МППА с глюкозой и краской — генциан фиолетовый или малахитовая зелень). За­сеянные среды помещают в термостат при +37—38 °С на 30 дней. Следует учиты­вать что В. abortus в первых генерациях растет при пониженном содержании 0₂. По­этому половину посевов из пат.материала от крупного рогатого скота культивируют при обычных условиях, другую половину (и все посевы при выделении В. ovis) — в атмосфере, содержащей 10—15 % углекислоты (в эксикаторах). Все посевы про­сматривают через сутки, затем через каждые 3—4 дня. Рост бруцелл проявляется через 7—10—30 и даже 40 дней. По мере адаптации к питательным средам рост культуры может появиться на 2—3-й день. На плотных питательных средах рост бруцелл проявляется мелкими прозрачными выпуклыми, округлыми, блестящими колониями с гладкой (S-формы) поверхностью и голубова­тым оттенком (встречаются и R-формы). При более длительном культивировании ко­лонии мутнеют, с появлением пигмента — темнеют, сливаются. В жидких питатель­ных средах рост бруцелл проявляется вначале равномерным помутнением и образо­ванием пристеночного кольца голубоватого оттенка; впоследствии образуется незна­чительный осадок. При обнаружении роста из типичных колоний готовят мазки, ок­рашивают специальными методами и просматривают под микроскопом. Затем пере­севают на плотную питательную среду и культивируют при тех же условиях.

Культу­ры идентифицируют по тинкториальным, морфологическим, культуральным свойст­вам. Кроме того, ставят РА на предметном стекле с позитивной бруцеллезной сыво­роткой, разведенной 1:50 и 1:2 (для выявления слабо агглютинирующих культур). Первичную культуру Br.ovis надлежит подвергнуть серологической идентификации - чистой выделенной культурой гипериммунизируют кроликов, затем их сыворотку исследуют в РДСК с антигеном Br.ovis (овисный антиген).

Биопроба осуществляется заражением морских свинок (параллельно с по­севами материала на питательные среды), которых предварительно подвергают серологическому контролю посредством РА (должен быть отрицательный ре­зультат в разведении сыворотки 1:5). Суспензию из ткани органов, содержимого желудка плода (1:10 в физрастворе) в дозе 1 мл, осадка после центрифугирования проб молока с добавленными сливками из верхнего слоя — 2—3 мл вводят мор­ской свинке подкожно с внутренней стороны бедра. Свинка не погибает. На 15— 25-й и 40-й день после заражения у свинок исследуют пробы сывороток крови пробирочным методом РА в разведениях от 1:10 до 1:80. При получении положи­тельных результатов морских свинок убивают и из органов делают посевы на пи­тательные среды с целью выделения культуры бруцелл. При выделении культуры возбудителя или получении положительного результата РА в титре 1:10 и выше лабораторный диагноз бруцеллеза считают установленным.

Все выделенные культуры бруцелл после их идентификации уничтожают автоклавированием при 1,5 атм в течение 1 часа. При необходимости определения вида бруцелл выделенную культуру на­правляют в областную (или республиканскую) лабораторию или в НИИ, имею­щие разрешение на работу с особо опасными инфекциями, где и определяют ферментативную (биохимическую) активность чистой культуры и учитывают дифференциальные признаки бруцелл.

Биохимические свойства. Желатину и свернутую сыворотку бруцеллы не разжижают, индол не образуют, сероводород и аммиак образуют в зависимости от вида и штамма. Молоко не свертывают, образуют каталазу. Ферментируют глюкозу, арабинозу, декстрозу, левулезу и др. с образованием кислоты.

Для дифференциации видов бруцелл используют чистые культуры (в S-форме). Наличие диссоциации культуры бруцелл определяют путем реакции термоагглютинации, пробы с флавакридином, окраской колоний кристаллвиоле-том. Посредством последнего метода устанавливают: если после внесения пасте­ровской пипеткой в культуру, выросшую в чашке Петри, краски в разведении 1:2000, приготовленной ex tempore (ее отсасывают из чашки через 5 минут), ко­лонии, просматриваемые под лупой, окрашены в темно-фиолетовый цвет,— культура диссоциированная. Если же колонии зеленого цвета или светло-желтого, значит, культура недиссоциирована (S-форма). Из типичных S-форм колоний микроорганизмы пересевают на скошенный МППА (в пробирках) и вы­росшую культуру идентифицируют по показателям.

Серологическая диагностика бруцеллеза осуществляется посредством про­бирочной РА, РСК, РДСК, розбенгал-пробы (РБП) с сыворотками крови исследо­вания молока с помощью кольцевой реакции (КР), ИФА, ПЦР.