Тема: Возбудители туберкулеза и паратуберкулеза

Цель занятия: Ознакомить студентов с правилами взятия проб материала, его упаковки и пересылки в лабораторию, с методами обработки (подготовки) пат.материала для бактериологического исследования. Усвоить методы бактерио­логического анализа поступившего в лабораторию материала.

Задание:

1. Изготовить 3 препарата-мазка: 2 из смеси микобактерий - один из них окра­сить по Граму, другой - методом Циль-Нильсена, третий мазок из культуры М. Phlei, окрасить методом Циль-Нильсена;

2. Все мазки просмотреть под микроскопом, микрокартину зарисовать в тетради;

3. Культуру M. Phlei засеять на среду Петраньяни и среду со стрептомицином, а для контроля - в пробирки с обычным МПБ и МПА;

4. Просмотреть готовые окрашенные демонстрационные препараты.

Материалы и оборудование: Пробирка со смесью взвеси убитых микобактерий туберкулеза и любых некислотоустойчивых бактерий, пробирка с чистой культу­рой палочки тимофеевой травы (Mycobacterium phlei), пробирка со средой Пет­раньяни, пробирка с глицериновым МПБ, пробирка со средой, содержащей стрептомицин. Для демонстрации необходимы таблицы, готовый препарат-мазок микобактерий туберкулеза, окрашенный по методу Циля -Нильсена; культура микобактерий на среде Петраньяни и на глицериновом картофеле (в запаянных пробирках Ру); биопрепараты.

Классификация:

Отдел – Firmicutes;

Секция – 16 – микобактерии;

Порядок – Actinomycetales - нитевидные, ветвящиеся клетки;

Семейство – Mycobacteriaceae;

Род – Mycobacterium;

Виды – M.tuberculosis – возбудитель туберкулеза человека; M.bovis – туберкулез крс;

M.avium – туберкулез птиц; M.paratuberculosis – возбудитель паратуберкулеза;

M.leprae – возбудитель проказы.

Возбудитель туберкулеза. Наибольшее значение в патологии сельскохозяйственных животных (и человека) имеют следующие виды микобактерий: Mycobacterium tuberculosis, М. bovis и М. avium.

Туберкулез — инфекционное, хронически протекающее заболевание человека, животных, в том числе и птиц. Патологоанатомически он характеризуется образовани­ем в различных тканях и органах специфических очагов-бугорков (туберкул), по мере развития процесса подвергающихся творожистому перерождению.

Патологический материал для бактериологического исследования направля­ют как при жизни животного (истечения из носа, бронхиальную слизь, молоко — особенно при увеличении надвыменных лимфоузлов, фекалии, реже мочу), так и посмертно (пораженные части органов с туберкулами и лимфоузлы — бронхиальные, заглоточные, средостенные, предлопаточные, надвыменные). Труп птицы (или тушку) на­правляют целиком — исследуют пораженные печень, селезенку, легкие, яичники. При взятии патологического материала необходимо соблюдать правила асептики, личной профилактики и технику безопасности. Материал в лабораторию доставля­ют свежим. Если нет условий соблюдения этого, то лимфоузлы, кусочки тканей ор­ганов консервируют в 30—40 %-ном водном растворе глицерина или посылают в замороженном состоянии. Обсемененность исследуемого материала микобактериями туберкулеза может быть незначительной. Поэтому, чтобы повысить концентра­цию возбудителя в пробах (для большей достоверности результатов исследования), применяют специальные методы обработки и обогащения.

Мокроту, слизь, гной заливают равным объемом 10 %-ного раствора трех-замещенного фосфата натрия, хорошо перемешивают и ставят в термостат на 24 часа. Затем центрифугируют при 3000 об/мин 10—15 минут. Исследуют осадок.

Пораженные ткани нарезают мелкими кусочками и растирают в стериль­ной ступке с 6%-ной серной кислотой в соотношении 1: 4, фильтруют через два слоя марли, центрифугируют, кислоту отсасывают, к осадку добавляют физрас­твор, вновь встряхивают и центрифугируют. Так промывают 2—3 раза. Промы­тый осадок высевают на питательные среды и готовят мазки.

Молоко — всю пробу (150 мл) центрифугируют при 3000 об/мин 20—30 минут. Осадок обрабатывают 6 %-ным раствором" серной кислоты, промывают физраствором, центрифугируют. Исследуют осадок и слой сливок.

Маcло (2—4 г) вносят в стерильную пробирку, заливают горячей водой, за­крывают резиновой пробкой, встряхивают 5—10 минут, перевертывают пробирку вверх дном, ставят в штатив, оставляют в прохладном месте. Когда масло засты­нет осторожно приоткрывают пробку, жидкость выливают в центрифужные про­бирки, далее исследуют, как молоко.

Фекалии. (50 г) растирают в стерильной ступке с 18%-ным раствором сер­ной кислоты, фильтруют через марлю, центрифугируют, исследуют осадок, как в предыдущих случаях.

Помимо описанной методики обработки материала (по Маккавейской), рекомендуется также готовить материал по методу Венота и Моро: 2—4 г фекалий растирают в ступке, разбавляют 25%-ным раствором NaCI до жидкой консистенции, фильтруют через марлю, затем в центрифужную пробирку вносят 5 мл фильтрата, добавляют 1 мл петролейного эфира или авиационного бензина, перемешивают, плотно закрывают корковой пробкой и центрифугируют 15—25 минут. Из нижней части образовавшегося на поверхности кольца берут материал для исследования.

Концентрирование микобактерий осуществляют также методом флотации. Исследуемый материал подготавливают, как обычно. Затем в колбу с узким гор­лом вносят 10 мл материала, добавляют 10 мл 1 %-ного раствора NaOH, плотно закрывают и встряхивают 10 минут. После этого взвесь разводят 1:10 дистилли­рованной водой, добавляют 1— 2 мл ксилола (петролейного эфира или бензина), вновь встряхивают 5—10 минут, доливают дистиллированную воду до уровня горлышка колбы и выдерживают 30 минут при комнатной температуре. Всплыв­шие капельки ксилола (эфира, бензина) увлекают за собой микобактерий, образуя флотационное кольцо, содержимое которого исследуют. Подготовленный после обработки поступивший материал исследуют.

Микроскопия. Возбудитель туберкулеза относится к группе кислото-спирто-щелочеустойчивых бактерий, что обусловлено наличием стеариновых кислот (миколовой, пионовой) и других воскоподобных веществ на поверхности клетки (в се оболочке). Эти вещества придают микробной клетке гидрофобность, то есть способность отталкивать воду и водные растворы красителей, кислот, щелочей. В связи с этим бактерии туберкулеза (и паратуберкулеза) трудно воспринимают краску. Для окрашивания бактерий этой группы применяют специальные методы, среди которых наиболее распространенным является метод Циля — Нильсена. После окраски этим методом микобактерий приобретают розово-красный цвет, по Граму окрашиваются положительно.

Для микроскопического исследования патологического материала реко­мендован также люминесцентный метод. Метод обладает высокой чувствительностью, дает цветное изображение объекта (золотисто-желтый цвет).

Окраска препаратов по Поляковой: маз­ки из обогащенного материала, подготовленного к посеву, или непосредственно из тканей органов фиксируют на пламени. Окрашивают специальным раствором (0,1 г аурамина, 0,01 г родамина С, 100 мл дистиллированной воды) 10—15 ми­нут, осторожно промывают водой. Затем обесцвечивают 3 %-ным раствором со­ляной кислоты в 70 %-ном этиловом спирте в течение 15— 30 секунд и промы­вают водой. После этого гасят фон мазка раствором следующего состава: 1 г ки­слого фуксина, 1 г ледяной уксусной кислоты, 500 мл дистиллированной воды, воздействуя им на мазок 1—2 минут, промывают водой и дополнительно гасят фон метиленовым синим (синькой Леффлера) 2 минут. Промывают водой, сушат на воздухе. Просматривают под сухой системой микроскопа (Х40).

Возбудитель туберкулеза — бактерия палочковидной формы, длина 1,5—5 мкм, диаметр 0,5 мкм. М. tuberculosis — тонкая, слегка изогнутая палочка, М. bovis — короткая и толстая, М. avium — мельче остальных видов, обладает по­лиморфизмом. Микобактерий туберкулеза неподвижные, спору и капсулу не об­разуют. В мазках из исследуемого материала располагаются одиночно и неболь­шими скоплениями. В мазках из культуры, помимо одиночных бактерий, встре­чаются длинные нити с разветвлениями. Часто обнаруживаются неравномерность в окрашивании, наличие вцитоплазме зернистости (грамположите-льные некислото­устойчивые «зерна Муха»).

Культивирование и культуральные свойства. Микобактерии туберкулеза способны размножаться в строго аэробных условиях на соответствующих элективных питательных средах. Рост медленный (2— 4 недели и доль­ше). Культивируют при +37 °С (иногда в термостате выдерживают до 3 мес). На­личие роста в посевах учитывают каждые 2—3 дня в течение первых 10 дней, за­тем каждые 5 дней. Предварительно обработан­ный исследуемый материал высевают на питательные среды — элективные (из­бирательные): яично-крахмальные, картофельные с глицерином и краской для за­держания роста посторонних микроорганизмов. В диагностической лабораторной практике широко используется среда Пет­раньяни: 150 мл молока, 6 г картофельного крахмала, 1 г пептона, одна небольшая картофелина, нарезанная на мелкие кусочки. Все это нагревают 10 минут в водяной бане при помешивании и оставляют в ней на 1 час (продолжая помешивать) для ох­лаждения до +50 °С.

Затем добавляют целиком четыре яйца и один желток, 12 мл глицерина, 10 мл 2 %-ного водного раствора малахитовой зелени. Все тщательно пе­ремешивают, фильтруют через марлю, разливают по пробиркам и в наклонном поло­жении дробно стерилизуют в аппарате Коха (при этом происходит свертывание мас­сы среды) — первый день при +80 °С 20 минут, второй и третий дни — при +75 °С по 15 минут. Замена пептона аспарагином повышает ценность среды.

Используют также среды Левенштейна — Йенсена, Гельберга и жидкую среду Школьниковой. Культивировать можно и на обычном картофеле, пропи­ИИи 3—4 %-ным глицерином, на глицериновом МПБ и МПА.

Рост М. tuberculosis в глицериновом бульоне проявляется на поверхности среды в виде толстой складчатой пленки с широким пристеночным кольцом. На плотных средах рост обильный, колонии сухие бородавчатые или сморщенные, иногда в виде узелков, цвета слоновой кости (кремовый).

Рис. 16 Культура микобактерий на яичной среде Левенштейна-Йенсена

На среде Петраньяни колониисеровато-желтые. М. bovis растет в виде зеленоватых коло­ний на среде Петраньяни, в жидкой среде образует пленку тонкую, нежную, ино­гда сетчатую, не покрывающую всей поверхности среды. На плотных средах рост скудный, колонии сухие, мелкие, зернистые, серовато-белые. М. avium в жидких средах образует сначала сухую, затем ослизняющуюся пленку по всей поверхно­сти бульона. На плотных средах — влажный и слизистый налет. Колонии серова­то-белые или желтоватого цвета, по форме могут напоминать пуговицеобразное круглое возвышение, иногда кратеровидное углубление. На среде Петраньяни ко­лонии золотистые. М. avium растет быстрее, чем микобактерий остальных видов.

При исследовании мела, молока, воды следует учитывать возможность на­чни кислотоустойчивых сапрофитов (М. phlei и др.), которые растут на пита­тельных средах быстро по сравнению с патогенными микобактериями (4— 7 дней) Характерным для патогенных штаммов микобактерий является их особен­ность роста на средах в виде косичек, хорд (корд-фактор), что связано с наличием миколовой кислоты в клетках этих микобактерий.

При необходимости рекомендуется проводить ускоренное обнаружение микобактерий туберкулеза в посевах по методу Поляковой: готовят взвесь бактерийной массы в физрастворе NaCI концентрацией 10 мг/мл по оптическому стан­дарту для вакцины БЦЖ, и высевают петлей на стерильные полоски нитроцел-люлизных мембран, наложенные на поверхность среды Петраньяни (5 пробирок) таким образом, чтобы нижний конец полоски был опущен в конденсат. Инкуби­руют в термостате при +37—38 °С. На третий, седьмой и десятый дни культиви­рования стерильным пинцетом снимают по одной полоске, накладывают на предметное стекло, фиксируют над пламенем горелки и окрашивают аурамин — родамином 15 минут. Затем осторожно промывают и просматривают под люми­несцентным микроскопом. Данный метод позволяет обнаружить микроколонии микобактерий туберкулеза в виде светящихся золотисто-оранжевых или зе­леновато-желтых скоплений через 10 дней и ранее. Кислотоустойчивые сапрофиты вырастают к 3—7-му дню, колонии видимы простым глазом (визуально).

Для дифференциации отдельных видов микобактерий ставят биопробу на морских свинках, кроликах, а при необходимости — на курах, предварительно проверенных аллергическим методом (туберкулинизацией) для исключения спонтанного туберкулеза. Для заражения применяют либо культуру, либо при­сланный в лабораторию материал, который предварительно обрабатывают серной кислотой, как указывалось выше, растирая в стерильной ступке. К осадку после центрифугирования добавляют 15 %-ный раствор двууглекислой соды, оставляют на 10—15 минут и вновь центрифугируют 5 минут. Образовавшийся осадок два­жды промывают стерильным физраствором с последующим центрифугировани­ем, а затем осадок вновь суспендируют в физрастворе, отстаивают 5—10 минут. Надосадочную жидкость вводят по 1—2 мл морским свинкам в паховую область, кроликам — внутривенно. У морских свинок в положительных случаях (патогенный штамм) через 2—3 недели на месте введения образуется уп­лотнение, потом язва с одновременным увеличением регионарных лимфоузлов. Этим свинкам через 2—3 недели подкожно инъецируют туберкулин (аллерген — фильтрат убитых автоклавированием микобактерий), что приводит к бурной ге­нерализации процесса и гибели животных.

При вскрытии из типичных туберкулов готовят мазки и делают высевы на питательные среды. М. bovis вызывает генерализованный процесс туберкулеза у кроликов и морских свинок. М. tuberculosis патогенен лишь для морских свинок, вызывая заболевание в период от 3 недель до 3 месяцев после заражения. М. avium, как правило, обусловливает у кроликов септический процесс без образо­вания специфических туберкулов и приводит к быстрой гибели животных (осо­бенно при внутривенном заражении).

При выделении слабовирулентных культур (и с атипичным ростом) микобактерии туберкулеза необ­ходимо дифференцировать от кислотоустойчивых сапрофитов, используя три теста. 1. Определение каталазной активности. В про­бирку с культурой на яичной среде вносят 50 %-ный раствор перекиси водорода так, чтобы была покрыта вся поверхность среды. С момента появления пузырьков газа учитывают результат. Хотя каталазной активностью обладают все кислото­устойчивые бактерии, у сапрофитов она выражена интенсивнее. 2. Определение формамидазной активности. Суспензию культуры с поверхности яичной среды обрабатывают растворами формамида, затем последовательно сернокислым мар­ганцем, феноловым реактивом и гипохлоридом кальция.

Появление си­него кольца указывает на положительную формамидазную активность, прису­щую кислотоустойчивым сапрофитам. 3. Определение лекарственной устойчиво­сти осуществляют с культурами, выросшими на питательных средах с добавле­нием различных концентраций туберкулостатических препаратов (стрептомицин, фтивазид, ПАСК и др.). Вирулентные штаммы М. tuberculosis и М. bovis, как пра­вило, чувствительны к действию этих препаратов. Между тем атипичные штам­мы, кислотоустойчивые сапрофиты и М. avium обладают резистентностью в от­ношении антитуберкулезных лечебных препаратов.

Возбудитель паратуберкулеза (паратуберкулезного эн­терита крупного рогатого скота по данной методике). — Mycobacterium paratuberculosis. Поражает преимущественно крупный рогатый скот, реже овец, верблюдов и очень редко коз и оленей. Паратуберкулез — хроническая инфекционная болезнь, характеризую­щаяся образованием отечно-воспалительных складок слизистого и подслизистого слоя пораженного отдела кишечника, снижением продуктивности и прогресси­рующим истощением.

Патологический материал направляют в лабораторию как при жизни жи­вотного (фекалии с комочками слизи и примесью крови, соскобы со слизистой оболочки прямой кишки), так и посмертно или при убое (пораженные участки кишечника, отрезок подвздошной кишки, перевязанный с двух сторон, мезентериальные лимфоузлы). Материал берут с соблюдением правил асептики, консер­вируют 30%-ным раствором глицерина (для гистологического исследования консервируют 10%-ным раствором формалина).

Бактериологический диагноз базируется в основном на микроскопировании препаратов, так как выделение чистой культуры возбудителя сопряжено с боль­ИИи трудностями. Биопробу при диагностике паратуберкулеза не проводят (ла­бораторные животные невосприимчивы). Поступающий в лабораторию патматериал подвергается обработке (подго­товке). Учитывая загрязненность посторонней микрофлорой, его предварительно очищают и концентрируют возбудителя, как и при диагностике туберкулеза.

Микроскопия. М. paratuberculosis — мелкая тонкая грамположительная па­лочка длиной 0,5—1,5 мкм, диаметром 0,2—0,5 мкм, неподвижная, споры и кап­сулы не образует, кислотоустойчивая. В препаратах-отпечатках располагается скоплениями (кучками), гнездами, редко одиночно или по 2—4 клетки. Отмеча­ется полиморфизм, палочки могут быть расширенными, напоминая контуры бутылки, ручной гранаты, иметь вид бесструктурных глыбок, мелких кокков. В мазках из культуры палочки длиннее, стройнее, менее скученные, в отдельных клетках видна зернистость.

В связи с тем, что выделение возбудителя паратуберкулеза из организма больного животного с фекалиями происходит периодически, при сомнительном или отрицательном результате микроскопии исследование повторяют. Кроме све­товой, можно пользоваться люминесцентной микроскопией препаратов — отпе­чатков из патологического материала или полученной чистой культуры, окра­шенных флуорохрамами по специальной методике.

Для выделения чистой культуры материал высевают на специальные пита­тельные среды (на общеупотребительных средах возбудитель паратуберкулеза не растет). Лучший рост наблюдают при добавлении к питательным средам вытяжки из убитых бактерий туберкулеза или кислотоустойчивых сапрофитов (М. phlei). Применяют модифицированную среду Дюбо—Смита: К2НР04— 1,0; Na2HP04— 6,25; MgS04—0,01; СаС12 г — 0,0005; ZnS04 — 0,0001; CuS04— 0,0001; лимон­нокислое аммонийное железо — 0,05, аспарагин— 1,0, гидролизат казеина—80 мл, спиртовой экстракт микобактерий флеи — 20 мл; сыворотка крупного рогато­го скота 20 %; пенициллин из расчета 50 ЕД на 1 мл среды и 15,0 агара Дифко; дистиллированная вода до 1000 мл. Перед посевом на питательные среды патоло­гический материал обрабатывают 5 %-ным раствором серной кислоты, промыва­ют физраствором, растирают в ступке и высевают на описанные среды или на среды Петраньяни и казеиновую с названным выше фактором роста. Посевы ста­вят в термостат при +38 °С, через 2 дня пробирки парафинируют.

Результат учитывают через 15 дней, затем каждые 5 дней. Рост просматри­вают с помощью лупы. Первичный рост на казеиновой среде отмечают к 18—20-му дню при сильной обсемененности засеваемого материала. При слабой обсеме­ненное™ — в более поздние сроки. На плотных (элективных) средах колонии плоские, сухие, серовато-беловатые, с неровными краями. По мере роста края приобретают бугристость, не отличаясь от колоний других видов микобактерий. В первичных культурах на среде Петраньяни рост отсутствует, что обычно учи­тывают при идентификации культур. В жидких средах (МПБ с глицерином, син­тетические среды) на поверхности образуется нежная беловатая пленка, которая в силу собственной тяжести опускается на дно.

Дифференциация возбудителя паратуберкулезного энтерита и возбудителя туберкулеза основывается главным образом на двух факторах:

1) культивирова­ние микобактерий паратуберкулеза возможно только на средах с добавлением фактора роста;

2) лабораторные животные невосприимчивы к возбудителю паратуберкулеза.

Серодиагностика паратуберкулеза проводится РСК с пробами сыворотки крови по общепринятой методике (с паратуберкулезным антигеном Сибирского НИИ, представляющим собой метаноловый экстракт микробной массы М. paratuberculosis).

В ветеринарной практике широко используют аллергический метод диаг­ностики паратуберкулеза в соответствии с действующей инструкцией — двойной внутрикожной пробой туберкулином (для птиц) или паратуберкулином.

 

Контрольные вопросы:

1. Морфологические, тинкториальные особенности М. tuberculosis;

2. Питательные среды для культивирования микобактерий, культуральные свой­ства и идентификация видов микобактерий туберкулеза;

3. Дифференциация микобактерий от кислотоустойчивых сапрофитов;

4. Особенности биопробы при диагностике туберкулеза и как дифференцирующий критерий от возбудителя паратуберкулеза;

5. Патологический материал, его подготовка и бактериологическое исследование для диагностики туберкулеза;

6. Морфологические, тинкториальные и биологические особенности возбудителя паратуберкулеза, его дифференциация от возбудителя туберкулеза.