Цитологические доказательства кроссинговера.

После того как генетическими методами удалось установить явление кроссинговера, необходимо было получить прямое доказательство обмена участками гомологичных хромосом, сопровождающегося рекомбинацией генов. Наблюдаемые в профазе мейоза картины хиазм могут служить лишь косвенным доказательством этого явления, констатация происшедшего обмена прямым наблюдением невозможна, так как обменивающиеся участками гомологичные хромосомы обычно абсолютно одинаковы по величине и форме.

Г. Крейтон и Б. МакКлинток удалось получить у кукурузы форму, у которой гомологичные хромосомы различались морфологически – одна была нормальной, а другая несла утолщение на конце одного плеча, второе ее плечо было удлинено. Эти особенности в строении пары хромосом легко обнаруживались при цитологических исследованиях.

В опыте нормальная хромосома несла рецессивный ген с (colorless – неокрашенный эндо-сперм) и доминантный ген wx+ (крахмалистый эндосперм), измененная хромосома – доминантный ген с+ (окрашенный эндосперм) и рецессивный ген wx (waxy – восковидный эндосперм). Дигетерозиготу с+ сwx+ wx скрещивали с линией, имеющей морфологически нормальные хромосомы, меченные рецессивными генами с и wx. В потомстве получили как некроссоверные, так и кроссоверные зерна. При цитологическом изучении их было обнаружено, что кроссоверные зерна неизменно содержали хромосомы с обменявшимися участками: нормальной длины, но с утолщением или удлиненную без утолщения.

К. Штерн исследовал расщепление в потомстве от скрещивания самок дрозофил, дигетерозиготных по генам Х-хромосомы: cr (carnation) глаза цвета гвоздики, рецессив; cr+ - нормальная темно-красная окраска глаз, доминант; B (Bar) – полосковидные глаза, доминант: B+ - круглые глаза, рецессив.

Эти же самки несли гетероморфные Х-хромосомы: одну сильно укороченную вследствие транслокации ее бесцентромерного участка на четвертую – микрохромосому, другую – Г-образную – вследствие транслокации на нее фрагмента Y-хромосомы. Таких самок скрещивали с самцами, несущими рецессивные аллели исследуемых генов (cr, B+) в Х-хромосоме обычной формы и имевшими обычную Y-хромосому. Результат кроссинговера у самок в таком скрещивании – рекомбинантные классы – изучали цитологически.

 

ЭКЗАМЕНАЦИОННЫЙ БИЛЕТ № 14

1. Половые хромосомы, гомо- и гетерогаметный пол; типы хромосомного определения пола. Наследование признаков, сцепленных с полом. Значение реципрокных скрещиваний для изучения сцепленных с полом признаков. Наследование при нерасхождении половых хромосом. Балансовая теория определения пола. Гинандроморфизм.

Половые хромосомы, или гоносомы, — хромосомы, набор которых отличает мужские и женские особи у животных и растений с хромосомным определением пола.

Дрозофилы: ♀ и ♂ имеют 4 пары хромосом, три из которых одинаковы у тех, и у других, а одна пара у ♀ представлена двумя одинаковыми Х-хромосомами. А у ♂ - одной Х и одной Y-хромосомой. Y от Х отличается по форме и она почти целиком состоит из гетерохроматина. При скрещивании ♀ образую только один тип гамет (гомогаметный пол), а ♂ - два типа гамет (гетерогаметный пол). Случайное сочетание этих гамет ♀ и ♂ обеспечивает статистически равное число самцов и самок в каждом поколении. Y-хромосома не определяет пола, но в ней находятся гены фертильности самцов. (Х0-самцы стерильны).

Хромосомный механизм определения пола широко распространён в природе. Различают несколько типов хромосомного определения пола в зависимости от того, какой пол гетеро- и гомогаметный.

♀	♂	Объект
ХХ	ХY	Человек, дрозофила
ХХ	X0	Кузнечик
ZW	ZZ	Птицы, бабочки
Z0	ZZ	Моль

У растений хромосомный механизм подразделяется на 2 типа: 1) активную роль в определении пола играет Y-хромосома (муж.пол) 2) пол определяется балансом аутосом и Х-хромосом, Y-хромосома инертна.
Т.о. гетерогаметен ♂ пол (ХY), ♀, как правило гомогаметен (ХХ), за исключением некоторых видов.

У части животных (пчелы, муравьи, осы) существует гапло-диплоидный тип определения пола. У них нет половых хромосом. ♀ развиваются из оплодотворённых яиц и они диплоидны, а ♂ - из неоплодотворённых, и они гаплоидны.

Сцепление с полом: крисс-кросс - в результате признаки отцов проявляются у дочерей, а признаки матерей — у сыновей. Название такому типу наследования дал один из авторов хромосомной теории наследования Томас Хант Морган. Он впервые описал такой тип наследования для признака цвета глаз у дрозофилы в 1911 году. Крисс-кросс наследование наблюдается тогда, когда мать является гомозиготой по рецессивному признаку, локализованному в Х-хромосоме, а у отца в единственной Х-хромосоме имеется доминантный аллель этого гена.

Реципрокные скрещивания — два эксперимента по скрещиванию, характеризующиеся прямо противоположным сочетанием пола и исследуемого признака. В одном эксперименте самца, имеющего определенный доминантный признак, скрещивают с самкой, имеющей рецессивный признак. Во втором, соответственно, скрещивают самку с доминантным признаком и самца с рецессивным признаком. Используется для определения роли пола в наследовании признака, а также позволяет определить, от какого из родителей передаются потомству цитоплазматические наследственные факторы. Для проведения реципрокного скрещивания родительские формы должны быть чистыми линиями.

Как показал Морган, при скрещивании белоглазых самок дрозофилы с красноглазыми самцами дочери оказываются красноглазыми, а сыновья - белоглазыми. Однако из правила бывают исключения. Примерно у одной из двух тысяч мух в F₁ от такого скрещивания цвет глаз оказывается противоположным: белым у самок и красным у самцов. Бриджес предположил, что появление редких мух возможно при нерасхождении Х-хромосом - когда Х-хромосомы не расходятся в мейозе к разным полюсам, а направляются вместе к одному из полюсов, в результате чего образуются яйцеклетки с двумя Х-хромосомами и яйцеклетки без Х-хромосом. Если у белоглазой мухи образуется яйцеклетка с двумя Х-хромосомами и эта яйцеклетка оплодотворяется спермием, содержащим Y-xpoмосому, то образовавшаяся зигота имеет две Х-хромосомы и одну Υ-хромосому, причем обе Х-хромосомы содержат ген белых глаз. Бриджес предположил, что белоглазые самки в потомстве от скрещивания между красноглазыми самцами и белоглазыми самками развиваются именно из таких зигот. Когда же яйцеклетка, не содержащая ни одной Х-хромосомы, оплодотворяется спермием красноглазого самца, несущим Х-хромосому, то в зиготе оказывается одна Х-хромосома, несущая ген красных глаз, а Y-хромосомы нет вовсе. Бриджес предположил, что из таких зигот развиваются красноглазые самцы. Другими словами, гипотеза Бриджеса состояла в том, что появляющиеся с частотой 1:2000 белоглазые самки получают по две Х-хромосомы от матери (и Y-хромосому от отца), а такие же редкие красноглазые самцы получают лишь одну отцовскую Х-хромосому (и, следовательно, вовсе лишены Y-хромосомы). Самцы дрозофилы, лишенные Y-хромосомы, внешне нормальны, но стерильны. Самки с двумя Х-хромосомами и одной Y-хромосомой нормальны и плодовиты. Бриджес скрещивал таких самок (ΧΧΥ) с нормальными красноглазыми самцами (ΧΥ). Он обнаружил, что около 4% самок в потомстве от таких скрещиваний имеют белые глаза, а около 4% самцов - красные глаза; остальные 96% потомства составляли красноглазые самки и белоглазые самцы. Бриджес предположил, что эти 4% составляют самки и самцы, возникающие снова в результате нерасхождения Х-хромосом в мейозе у самок. Он назвал такое нерасхождение вторичным, поскольку оно происходит в потомстве самок, появившихся в результате первичного нерасхождения Х-хромосом (и потому обладающих двумя Х-хромосомами и одной Y-хромосомой). Вторичное нерасхождение происходит с частотой около 1:25, т. е. примерно в 100 раз чаще, чем первичное нерасхождение (1:2000).

Распределение хромосом может нарушаться не только в мейозе, но и в митозе. Изредка получались мухи, у которых один глаз белый, а другой – красный. И оказывается, что у таких мух одна половина тела женская, а другая – мужская. Такие мухи называются гинандоморфами. Белый глаз принадлежит мужской половине. Такие особи возникают в результате потери одной Х-хромосомы при первом делении ядра зиготы, которая должна дать начало самке.

Балансовая теория Бриджеса. Пол у дрозофил определяется соотношением числа аутосом (А) и половых хромосом (Х).

3Х:3А – триплоидные самки

2Х:2А – самки

1Х:2А – самцы

2Х:3А – интерсексы

3Х:2А – суперсамки

1Х:3А – суперсамцы

Принципы регуляции действия генов у эукариот. Транскрипционно активный хроматин. Регуляторная роль гистонов, негистоновых белков, гормонов. Особенности организации промоторной области у эукариот. Посттранскрипционный уровень регуляции синтеза белков. Роль мигрирующих генетических элементов в регуляции генного действия.

Все клетки любого организма имеют полный набор свойственных данному организму генов. У любого организма клетки разных тканей и органов отличаются по набору имеющихся в них белков. Даже в одной клетке на разных стадиях ее развития синтезируются и функционируют разные белки. Следовательно, располагая полной генетической информацией, каждая клетка на определенном этапе развития использует лишь ту ее часть, которая необходима в настоящий момент, транскрибируются только те гены, продукты которых нужны клетке в данный момент для отправления ее функций. Следовательно, клетка должна располагать механизмами, определяющими, какие гены и в какой последовательности должны транскрибироваться. По принципам регуляции гены эукариотов можно условно разделить на три группы: 1) функционирующие во всех клетках организма; 2) функционирующие только в тканях одного типа; 3) обеспечивающие выполнение специализированными клетками конкретных функций. Для эукариотической клетки характерно:

1. Наличие интронов и экзонов в молекуле ДНК.

2. Созревание и-РНК - вырезание интронов и сшивка экзонов.

3. Наличие регуляторных элементов, регулирующих транскрипцию, таких как: а) промоторы - 3 вида, на каждый из которых садится специфическая полимераза. РНК-полимераза I реплицирует рибосомные гены, РНК-полимераза II - структурные гены белков, РНК-полимераза III - гены, кодирующие небольшие РНК. Промоторы РНК-полимеразы I и РНК-полимеразы II находятся перед участком инициации транскрипции, промотор РНК-полимеразы III - в рамках структурного гена; б) модуляторы - последовательности ДНК, усиливающие уровень транскрипции; в) (энхансеры) усилители - последовательности, усиливающие уровень транскрипции и действующие независимо от своего положения относительно кодирующей части гена и состояния начальной точки синтеза РНК; г) терминаторы - специфические последовательности, прекращающие и трансляцию, и транскрипцию.

Несмотря на индивидуальность набора регуляторных элементов у структурных генов эукариот, каждый из них имеет промоторный участок (ТАТА-бокс, или бокс Хогнесса) из восьми нуклеотидов, включающий последовательность TATA; последовательность ССААТ (САТ-бокс); участок из повторяющихся динуклеотидов GC (GC-бокс). Эти элементы находятся на расстоянии 25, 75 и 90 п.н. от сайта инициации соответственно. Транскрипция структурного гена эукариот начинается со связывания с ТАТА-боксом фактора транскрипции, который представляет собой комплекс по крайней мере из 14 белков. Затем с ним и участками ДНК, примыкающими к ТАТА-боксу, связываются другие факторы транскрипции, и, наконец, со всем этим транскрипционным комплексом связывается РНК-полимераза II. Затем при участии дополнительных факторов происходит инициация транскрипции.

В ядрах дифференцированных клеток хроматин имеет такую укладку, что только небольшое число генов (часто менее 1%) доступно для транскрипции. Различают участки гетерохроматина, в которых ДНК упакована очень компактно и недоступна для транскрипции, и участки эухроматина, имеющие более рыхлую укладку и способные связывать РНК-полимеразу. В разных типах клеток в область эухроматина попадают разные гены, а это означает, что в разных тканях транскрибируются разные участки хроматина.

Стойкая репрессия генов гетерохроматина обеспечивается:

· пространственной укладкой ДНК, при которой гетерохроматин находится в высококонденсированном состоянии;

· метилированием дезоксицитидина ДНК-ме-тилазами в 5'-CG-3' последовательностях ДНК. Эта модификация сильно меняет кон-формацию хроматина и препятствует активной транскрипции;

· связыванием с гистонами и образованием нуклеосом, которые также снижают транскрипционную активность ДНК.

Области эухроматина, в которых расположены активно транскрибируемые гены, обладают некоторыми структурными особенностями:

· они более чувствительны к действию ДНК-аз, чем остальные участки ДНК;

· молекулы гистонов, связанные с ДНК в этих участках, модифицированы. Результат этой серии ковалентных модификаций - снижение суммарного, положительного заряда гистонов и ослабление сродства нуклеосом к ДНК.

· к областям "активного" хроматина присоединяется группа негистоновых HMG-бел-ков, или белков с высокой подвижностью при гель-электрофорезе. Эти белки содержат много положительно заряженных аминокислотных остатков, связывание с которыми ослабляет взаимодействие ДНК и гистонов и вызывает дополнительное повышение транскрипционной активности генов.

С помощью методов молекулярной биологии было исследовано регуляторное действие гистонов и негистоновых хромосомных белков. Как выяснилось, гистоны, особенно гистон H1, оказывают тормозящее действие на ДНК-зависимый синтез РНК. Негистоновым хромосомным белкам тоже приписывают специфические регуляторные функции. Эти белки снимают блокирующее действие гистонов. На их важную роль указывают, помимо прочего, их большое многообразие, неодинаковое содержание их в хроматине различных тканей и на различных стадиях развития, а также результаты экспериментов по реконструкции хроматина.

ЭКЗАМЕНАЦИОННЫЙ БИЛЕТ № 15

Закономерности наследования при моногибридном скрещивании, открытые Г. Менделем: единообразие гибридов первого поколения, расщепление во втором поколении. Представление Г. Менделя о дискретной наследственности.

При моногибридном скрещивании гомозиготных особей, имеющих разные значения альтернативных признаков, гибриды являются единообразными по генотипу и фенотипу.