Задачи и методология генетической инженерии. Методы выделения и синтеза генов. Понятие о векторах. Векторы на основе плазмид и ДНК фагов. Геномные библиотеки.

Генетическая инженерия - конструирование in vitro функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК), или иначе - создание искусственных генетических программ (Баев А. А.). По Э. С. Пирузян генетическая инженерия - система экспериментальных приемов, позволяющих конструировать лабораторным путем (в пробирке) искусственные генетические структуры в виде так называемых рекомбинантных или гибридных молекул ДНК.

Речь идет о направленном, по заранее заданной программе конструировании молекулярных генетических систем вне организма с последующим введением их в живой организм. При этом рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата рецепиентного организма и сообщают ему новые уникальные генетические, биохимические, а затем и физиологические свойства.

Цель прикладной генетической инженерии заключается в конструировании таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы организму свойства, полезные для человека.

Технология рекомбинантных ДНК использует следующие методы:

· специфическое расщепление ДНК рестрицирующими нуклеазами, ускоряющее выделение и манипуляции с отдельными генами;

· быстрое секвенирование всех нуклеотидов очищенном фрагменте ДНК, что позволяет определить границы гена и аминокислотную последовательность, кодируемую им;

· конструирование рекомбинантной ДНК;

· гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая выявлять специфические последовательности РНК или ДНК с большей точностью и чувствительностью, основанную на их способности связывать комплементарные последовательности нуклеиновых кислот;

· клонирование ДНК: амплификация in vitro с помощью цепной полимеразной реакции или введение фрагмента ДНК в бактериальную клетку, которая после такой трансформации воспроизводит этот фрагмент в миллионах копий;

· введение рекомбинантной ДНК в клетки или организмы.

Получение генов. Главную роль на первом этапе выделения гена отводят эндонуклеазам рестрикции, или рестриктазам. Эти ферменты разрезают ДНК вблизи или внутри определенных последовательностей нуклеотидов, которые одинаковы на обеих комплимен-тарных цепях. Два разрыва в одинаковых позициях комплементарных цепей на концах фрагмента образуют липкие концы, которые могут вновь объединяться благодаря комплементарности оснований. Фрагменты рестрикции, или рестрикты, можно разделить по их молекулярной массе и заряду при помощи электрофореза в геле. Наряду с этим существует также способ химического синтеза генов – методология синтеза ДНК с заданной последовательностью нуклеотидов.

* 1. Химико-ферментативный синтез генов.

Осуществлен впервые в 1976 г. Гобином Корана. Это был ген, отвечающий за образование в генах дрожжей т-РНК для тирозина. Последовательность из 192n нуклеотидов.

Наиболее часто этот способ используется для генов небольших размеров, для продуктов которых установлена аминокислотная последовательность. В настоящее время синтезируется ген инсулина – 415 пар оснований.

Сначала устанавливается последовательность аминокислот в белковом продукте с учетом вырожденности генетического кода, происходит синтез коротких (10-15 пар нуклеотидов) однонитевых комплексов фрагментов. Затем такие синтезированные фрагменты смешиваются м/у собой, добавляется АТФ, изомераза, липаза. За счет случая идет объединение объектов. В результате в смеси продуктов реакции м. б. получены и интактные (необходимые) гены.

2. Выделение генов из природных (нативных) ДНК.

Шот-ган клонирование, метод «дробовика» - используется гидродинамическое воздействие на НК, либо рестриктазы II класса. В результате соединения выделенных фрагментов ДНК с векторными молекулами образуется банк генов (библиотека) ДНК. Трудно подобрать такой способ воздействия на ДНК, чтобы м. б. выделить интактный активный ген. При клонировании генов эукариот в клетках бактерий не происходит удаление интронов. Если размеры гена малы, то возникают сложности с его обнаружением в клетке.

3. Синтез гена на м-РНК, как матрице (получение комплемента (к-ДНК).

На первом этапе из клетки выделяется м-РНК, которая синтезируется в клетках, находящихся на определенной стадии роста. Или на определенных типах тканей.

К м-РНК добавляются тиминовые нуклеотиды и обратные транскрипты. На м-РНК с использованием полиадениловых фрагментов, как начало матрицы и за счет синтеза обратной транскриптазы образуется комплементарная ДНК. На следующем этапе используется щелочной гидролиз или РНК-аза, удаляющие нить м-РНК. Образуется 1-нитевая ДНК. После этого в присутствии НК, фермента ДНК-полимеразы и лигазы на нити ДНК как на матрицу синтезируется комплементарная цепь.

 

Векторные молекулы – это молекулы ДНК способные переносить и стабильно поддерживать в реципиентной клетке чужеродную генетическую информацию. Вектором м. б. ДНК плазмид вирусов, в т. ч. фагов. Векторы обладают следующими свойствами:

· Вектор должен быть репликоном и стабильно поддерживать в клетке, т. е. он должен распространятся в клетке как хромосомы в бактерии;

· Вектор должен иметь селективный маркер, позволяющий определить его наличие в реципиентной клетке (устойчивость к антибиотикам);

· Вектор должен иметь небольшое количество сайтов узнавания рестриктаз. Но количество рестриктаз должно быть мах. разнообразным.

· Емкость вектора – размер чужеродной ДНК, которую он может переносить без потери стабильности клетки. Фрагменты очень большого размера, вводимые в клетки теряются.

На первых этапах генной инженерии применялись естественные плазмиды E. Coli, в настоящее время работают с рекомбинантными плазмидами, которые несут два или три гена устойчивости.

Плазмидные векторы - кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК, имеющие клонирующий лимит до ~10 тнп (тысяч пар нуклеотидов). Плазмиды найдены практически у всех исследованных бактерий, у некоторых до ~10 видов разных плазмид, каждая из них выполняет свои характерные функции. Плазмиды также обнаружены у некоторых эукариот, например, у дрожжей – три типа различных плазмид. Некоторые плазмиды можно рассматривать как молекулярных паразитов, но многие кодируют важные функции, например, устойчивость к антибиотикам, тяжелым металлам, способность усваивать определенные вещества. В одной клетке могут сосуществовать только плазмиды, принадлежащие к разным группам совместимости. Каждая плазмида содержит сайт инициации репликации (ориджин, ori), специфичность которого определяет круг хозяев плазмиды, некоторые могут реплицироваться только в клетках одного вида, другие имеют широкий спектр хозяев. Размеры плазмид варьируют приблизительно от ~1 до 500 тпн. Каждая плазмида имеет постоянную определенную копийность в клетке – количество молекул на клетку. На основе плазмид сконструировано огромное количество различных векторов, поскольку единственным обязательным элементом плазмиды является небольшой сайт инициации репликации, с остальной последовательностью можно проводить любые манипуляции. Основным недостатком плазмидных векторов является их малая емкость в отношении клонируемых фрагментов ДНК. Выраженное делетирование больших вставок чужеродной ДНК в плазмидах связано с тем, что селективное преимущество в бактериях получают плазмиды с минимальными временем репликации.

Благодаря особенностям жизненного цикла вирусов, первые векторы (носители трансгенов) для генотерапии стали разрабатывать именно на их основе. Вирусы переносят чужеродные гены, которые затем способны экспрессироваться в зараженных клетках. Упрощенно вирус можно представить как нуклеиновую кислоту, упакованную в оболочку. Вирус проникает в клетку-мишень, где происходит экспрессия вирусного генома. Для создания хорошего вектора необходимо изменить некоторые свойства вируса. В большинстве случаев вирус должен быть лишен возможности к репродукции, чтобы предотвратить неконтролируемое распространение трансгена. Кроме того, часть вирусного генома необходимо удалить, чтобы освободить место для чужеродного генетического материала. Другие необходимые изменения зависят от типа вируса. Вирусные векторы широко используют в доклинических исследованиях и в настоящее время именно с ними проводят большинство клинических испытаний.

Геномная библиотека представляет собой набор ДНК всего генома одного организма. Эта ДНК хранится в популяции идентичных векторов, каждый из которых содержит различные вставки ДНК.. Для построения геномной библиотеки ДНК экстрагируют из клеток и затем расщепляют рестриктазой, чтобы разрезать ДНК на фрагменты определённого размера^[1][2]. Фрагменты затем встраивают в вектор с помощью фермента ДНК-лигазы. Далее вектор ДНК может быть встроен в организм-хозяин — обычно в популяцию кишечной палочки (E. coli) или дрожжей, где в каждой клетке содержатся копии вектора с одной, уникальной вставкой.

Этапы создания геномной библиотеки

1. Выделение тотальной ДНК

2. Фрагментация молекулы ДНК с помощью рестриктаз

3. Присоединение фрагментов ДНК к векторам переносчикам генов

4. Введение рекомбинантной ДНК в бактерию-реципиент.

ЭКЗАМЕНАЦИОННЫЙ БИЛЕТ № 19

Анализирующее скрещивание, анализ типов и анализ соотношения гамет у гибридов. Расщепление по фенотипу и генотипу во втором поколении и анализирующем скрещивании при моногенном контроле признака и разных типах аллельных взаимодействий.

Анализирующее скрещивание – это скрещивание формы с доминантным признаком и формы – гомозиготного рецессива. Гаметы ГМЗ рецессива анализируют генотип формы, несущей доминантный признак, вскрывают соотношение типов гамет, образуемых ГТЗ-ой, или выявляют гомозиготность доминантной формы.

Анализирующее скрещивание проводят с целью установления генотипа исследуемой особи с доминантными признаками в фенотипе. Для этого исходную особь скрещивают с рецессивной ГМЗ и по потомству судят о генотипе исследуемой особи.

А_
ГМЗ АА	ГТЗ Аа
Р: АА х аа	Р: Аа х аа
F ан.: Аа 100%	F ан.: Аа: аа (1:1)
В случае если в потомстве исследуемой особи не происходит расщепления, то исходная особь ГМЗ, АА.	В случае если в потомстве от скрещивания исследуемой особи с рецессивной ГМЗ произошло расщепление в соотношении 1:1, то исследуемая особь ГТЗ, Аа.

Анализирующее скрещивание широко применяют в практике с/х для установления чистопородности скрещиваемых сортов и пород.

На основе анализа своих скрещиваний Мендель пришел к выводу, что рецессивные задатки не исчезают в ГТЗ-ом организме, а остаются неизменными и вновь проявляются при встрече с такими же рецессивными задатками в последующих поколениях или в анализирующих скрещиваниях.

Позднее Бэтсон, исходя из этого феномена, сформулировал правило чистоты гамет, согласо которому явление расщепления основано на наследовании дискретных единиц – доминантных и рецессивных задатков (в 1902 г. Бэтсон предложил называть их аллеломорфами), не смешивающихся в ГТЗ организме и расходящихся «чистыми» при образовании гамет.

Расщепление по фенотипу и генотипу во втором поколении при моногенном контроле признака и разных типах аллельных взаимодействий:

(Взаимодействие генов – явление, когда за развитие признака отвечает несколько генов (аллелей). Аллельное взаимодействие – явление, при котором взаимодействуют гены одной аллельной пары; Неаллельное (межаллельное) – взаимодействуют гены разных аллельных пар).

1.Полное доминирование – такое взаимодействие, при котором один ген полностью подавляет действие другого. (примеры: цвет семян гороха, длина его стебля, форма семян…, цвет шерсти, длина шерсти…, цвет глаз, цвет волом у человека).

Р: АА (кариглаз.) х аа (голубоглаз).

F1: Аа кариглаз.

Аа х Аа

F2: 1АА, 2Аа, 1аа – по генотипу. По фенотипу: 3А_:1аа.

2.Неполное доминирование – промежуточный характер наследования признаков. Это такой тип взаимодействия аллельных генов, про котором доминантный ген НЕ полностью подавляет действие рецессивного гена, в следствие чего гибриды F1 (ГТЗ) имеют промежуточный между родительскими формами фенотипический вариант. При этом в F2 расщепление по генотипу и фенотипу совпадает: 1:2:1. (примеры: гиперхолестерия – когда холестерин не попадает в клетку. В ГМЗ – леталь, в ГТЗ – страдают во взрослом возрасте).

Р: АА (красный) х аа (белый)

F1: Аа (розовые)

Аа х Аа