Проблемы стабильности генетического материала.

1. Удивительная стабильность генетического материала – ДНК связана не с ее консервативностью, а с существованием в клетках всех живых организмов специальных систем репараций, устраняющих из ДНК возникающие в ней повреждения. Системы поддержания постоянства генотипа это и есть репарации.

Явление репарации, или восстановление жизнеспособности клетки, после действия на нее γ- и рентгеновых лучей было открыто в 1958 г. В. И. Корогодиным у диплоидных дрожжей. Повреждения ДНК, возникающие при действии излучений и химических агентов, в конечном счете приводят к нарушению регулярной Уотсон – Криковской структуры, что выражается в локальной денатурации молекулы и приводят к частичному или полному блокированию репликации. Именно такие нарушения конформации, а не конкретные изменения мономеров служат мишенью для большинства систем репарации ДНК.

Типы структурных повреждений в ДНК и репарационные процессы.

В настоящее время известны следующие типы систем репарации:

1) Химическая – восстанавливает химическую структуру модифицированных нуклеотидов.

2) Фотореактивация – восстановление ДНК, поврежденных УФ – излучением, под действием видимого света.

3) Эксцизионная – вырезание поврежденного участка ДНК и восстановление исходной структуры цепи (режь – латай)

4) Пострепликативная:

a) Рекомбинантная пострепликативная репарация после репликации поврежденной ДНК.

b) SOS – репарация – пострепликативная репарация склонная к ошибкам.

Фотореактивация

Явление фотореактивации заключается в восстановлении биологической активности клеток или молекул ДНК, поврежденных ультрафиолетовым излучением в результате последующего воздействия видимого света.

При фотореактивации происходит мономеризацияциклобутановыхдимеровтимина и других пиримидиновых димеровinsitu. Известна так называемая не ферментативная коротковолновая фотореактивация, которая заключается в мономеризациидимеров при действии ультрафиолетового света с длиной волны 240 нм, а также ферментативная фотореактивация. Именно последнюю обычно и подразумевают под собственно фотореактивацией.

Фотореактивация при действии видимого света (300—400 нм — наиболее активная часть спектра) была обнаружена в 1949 г. в нескольких лабораториях. Механизм этого явления был раскрыт в начале 60-х годов нашего века после выделения К. Рупертом из клеток микроорганизмов фермента фотореактивации — дезоксирибопиримидинфотолиазы. Экстракты дрожжей оказались способными восстанавливать трансформирующую активность ДНК Haemophyllusinfluenzae на свету.

Субстратом фермента фотореактивации служат димеры пиримидиновых оснований, с которыми он образует комплекс в темноте (с неповрежденной ДНК фермент не связывается). На свету комплекс распадается, при этом происходит мономеризациядимеров. В клетке эукариот фермент локализован в ядре, у прокариот — в непосредственной близости к нуклеоиду. В частности, он не обнаруживается в безнуклеоидныхминиклетках, которые образуют некоторые мутанты Е. coli.

Известен мутант phr Е. coli, у которого блокирована фотореактивация. При облучении видимым светом у этого мутанта не исчезают тиминовыедимеры из ДНК.

Фермент фотореактивации широко распространен в природе и обнаружен даже у таких примитивных свободноживущих микроорганизмов, как микоплазмы, найден он в клетках многих высших растений и животных. Он есть у всех изученных бактерий, за исключением Micrococcusradiodurans, который тем не менее чрезвычайно устойчив к действию ультрафиолетового света: он выдерживает дозы, в 1000 раз более высокие, чем те, которые убивают Е. coli. При полном отсутствии способности к фотореактивации М. radiodurans обладает мощной системой эксцизионной репарации.

Эксцизионная репарация

Эксцизионную репарацию, т. е. связанную с удалением поврежденного участка ДНК, называют также репарацией по типу выщепления — замещения или более образно «механизм режь — латай» Эксцизионная репарация не столь специфична в отношении повреждений ДНК, как фотореактивация, тем не менее наиболее подробно изучена именно репарация ДНК, содержащей тиминовыедимеры. Этому способствовало то обстоятельство, что возможность фотореактивации клеток — критерий присутствия тиминовыхдимеров в ДНК. Появление димеров приводит к локальной денатурации ДНК, что влечет за собой нарушение процесса репликации: каждый тиминовыйдимер в ДНК Е. coli задерживает репликацию на 10 с.

Доказательство существования и изучение механизма эксцизионной репарации стало возможным благодаря получению мутантов Е. coli, чувствительных к летальному действию ультрафиолетового света. Если штаммы Е. coli, устойчивые к ультрафио-летовому свету, инкубировать в темноте после облучения, то из их ДНК удаляются тиминовыедимеры. У мутантов, чувствительных к ультрафиолетовому свету, этого не происходит.

Эксцизионная репарация представляет собой многоэтапный процесс и заключается в: 1) «узнавании» димера, 2) надрезании одной цепи ДНК вблизи димера — инцизии, 3) удалении димера — эксцизии, 4) ресинтезе ДНК и 5) восстановлении непрерывности репарируемой цепи за счет образования ковалентных связей сахаро-фосфатного скелета молекулы.

«Узнавание» повреждения в ДНК осуществляет фермент УФ-эндонуклеаза, который реагирует не только на димеры тимина, но и на многие другие изменения, приводящие к локальному нapyшению структуры ДНК. Эндонуклеаза ответственна и за инцизию, т. е. надрезание одной цепи ДНК (разрыв фосфодиэфирных связей) непосредственно около димера с 5'-конца в поврежденной цепи. Эксперименты in vitro с облученной ДНК показали, что число однонитевых разрывов оказывается равным числу димеров в молекуле.

Эксцизию, или вырезание димера из молекулы ДНК, осуществляет другая нуклеаза. Димер удаляется в составе короткого олигонуклеотида (3—5 оснований), что может сопровождаться дальнейшей деградацией поврежденной спирали. Продукты деградации облученной ДНК, содержащие тиминовые димеры, можно обнаружить в клетках. У некоторых бактерий димеры находили и в культуральной среде. Деградацию ДНК осуществляет АТФ- зависимая ДНКаза. В результате эксцизии и последующей деградации ДНК образуются однонитевые бреши, или пробелы.

Ресинтез ДНК, в результате которого заполняются бреши, идет с использованием в качестве матрицы интактной цепи. Такой репаративный синтез ДНК напоминает «дополнительную» репликацию, обнаруженную в пахитенеу эукариот. Прямое доказательство репаративного синтеза у бактерий получили Д. Петтиджон и Ф. Хэнэуолт, использовавшие для этой цели метод М. Мезельсона и Ф. Сталя

ДНК Е. coli метили 14С, выращивая клетки в присутствии радиоактивноготимина, а затем изучали репликацию в присутствии 5-бромурацила, меченного 3Н. В результате нормальной репликации при центрифугировании в градиенте плотности можно наблюдать смещение пика распределения молекул: при этом бромурацил играет роль плотностной метки. В соответствии с этим гибридные молекулы ДНК оказываются меченными 14С и 3Н. При изучении тем же методом ДНК, выделенной из облученных клеток, обнаруживали только один пик, соответствующий по плотности исходным молекулам. Тем не менее эти молекулы содержали как |4С, так и небольшое количество 3Н

Этот пик радиоактивности появлялся вследствие включения 5-бромурацила в ДНК в ходе репаративного синтеза. Однако фрагменты ДНК, содержащие 5-бромурацил, столь невелики (в среднем пять нуклеотидов на один димер), что не влияют на плавучую плотность молекул, извлекаемых из клетки. Подтверждением предложенного объяснения наблюдаемой картины служило, во-первых, то, что фотореактивация снимала ресинтез ДНК: исчезал дополнительный пик радиоактивности 3Н; во-вторых, репаративный синтез не отмечался у мутантов, не способных выщеплять димеры тимина. Механизм синтеза ДНК, наблюдаемый в ходе репарации после ультрафиолетового облучения, получил наименование неполуконсервативного.

Основной фермент, ответственный за эксцизию димеров и репаративный синтез ДНК, — это ДНК-полимераза I, кодируемая геном pol А. Тем не менее у мутантов pol А, дефектных по ДНК- полимеразе I, все же наблюдается остаточный репаративный синтез, который связан с активностью ДНК-полимеразы II.

Известно, что неполуконсервативный синтез ДНК в 99% случаев происходит на коротких участках длиной до 30 нуклеотидов. За эту реакцию ответственна ДНК-полимераза I. В 1 % случаев синтез идет на гораздо более длинных отрезках — 1000—1500 нуклеотидов. По-видимому, эту реакцию и осуществляет ДНК-полимераза II.

Последний этап эксцизионной репарации заключается в восстановлении непрерывности репарируемой цепи ДНК с помощью фермента ДНК-лигазы, кодируемого геном lig Е. coli. Температурочувствительные мутанты по этому гену не способны не только завершать процесс эксцизионной репарации в непермиссивных условиях, но и накапливают фрагменты Оказаки при репликации ДНК.

Различные варианты эксцизионной репарации широко распространены у про- и эукариотических организмов. Она обнаружена у простейших (например, Tetrachimena pyriformis), в культуре клеток млекопитающих. Удаление тиминовыхдимеров из клеток млекопитающих сопровождается так называемым внеплановым синтезом ДНК, который происходит по репаративному типу: вне S-фазы клеточного цикла. Он аналогичен пахитенному синтезу ДНК в мейозе. Внеплановый синтез ДНК показан в зародышевых клетках и на постмейотических стадиях гаметогенеза у самцов мыши после действия этилметансульфоната. В ходе эксцизионной репарации у млекопитающих включается в среднем 20 новых нуклеотидов на каждый тиминовыйдимер. Известна мутантная линия клеток китайского хомячка с ослабленным (по сравнению с исходной линией) внеплановым синтезом ДНК, проявляющая повышенную чувствительность к ультрафиолетовому свету.

Нарушения процессов репарации ДНК обнаружены у людей, пораженных наследственным заболеванием — пигментной ксеродермой. Известно несколько типов этой болезни: XPI, XPII, XPvar, общими симптомами которой служит повышенная чувствительность к солнечному свету, приводящая к развитию рака кожи. Культура клеток больных XPI чувствительна к ультрафиолетовому свету, но не к ионизирующим излучениям. У этих больных дефект эксцизионной репарации связан с отсутствием активности УФ-эндонуклеазы. В культуре клеток здоровых людей после облучения ультрафиолетовым светом в дозе 10 Дж/м2 через 20 ч из ДНК исчезает до 90% тиминовыхдимеров (со скоростью 40 000 димеров в час), в то время как в клетках больных XPI димеры вообще не удаляются из ДНК.

Тип XPII чувствителен как к ультрафиолетовому, так и к рентгеновскому излучениям. Клетки XPII не способны репарировать ДНК, имеющую однонитевые разрывы. По-видимому, это связано с отсутствием в них фермента, аналогичного ДНК-полимеразе I Е. coli. Наконец, в клетках больных третьего типа — XPvar выщепление димеров тимина идет нормально, а дефект связан с иным типом репарации — пострепликативной.

Пострепликативная репарация

Этот тип репарации был открыт в клетках мутантов Е. coli, не способных выщеплятьтиминовыедимеры. В таких клетках после ультрафиолетового облучения происходит репликация ДНК, хотя и медленнее, чем в клетках дикого типа. У. Рапп и П. Говард-Фландерс показали, что в клетках мутантов uvr А после действия ультрафиолетового света синтезируется ДНК с однонитевыми пробелами, или брешами, причем длина вновь синтезированных фрагментов соответствует среднему расстоянию между возникшими в родительской ДНК тиминовымидимерами. Таким образом, после репликации нерепарированной ДНК против тиминовыхдимеров образуются бреши, которые, как оказалось, исчезают при последующей инкубации клеток в питательной среде. Этот тип репарации не происходит в клетках гес-мутантов, дефектных по рекомбинации (см. гл. 7). Поэтому пострепликативную репарацию называют также рекомбинационной репара-цией.

Механизм пострепликативной репарации наименее специфичен, так как здесь отсутствует этап узнавания повреждения. Представления об этом типе репарации связаны со знанием механизма рекомбинации Рекомбинационная пострепликативная репарация — это быстрый способ восстановления нативной структуры по крайней мере части дочерних молекул ДНК. При этом тиминовые димеры остаются в исходных родительских нитях. Эта репарация происходит уже в первые минуты после облучения.

Существует и другая разновидность — медленная пострепликативная репарация, для осуществления которой требуется несколько часов. Ее проводит система ферментов, которых нет в необлученных клетках и которую индуцирует облучение. Этот механизм получил наименование SOS-репарации. Его характерная черта — неточность восстановления первичной структуры ДНК, в связи с чем он получил также название репарации, склонной к ошибкам. При этом, по мнению ряда авторов, возможен репаративный синтез ДНК «в обход» тиминовых димеров, или, точнее за счет использования в качестве матрицы цепи ДНК, содержа щей димеры.

Пострепликативная репарация существует не только у бактерий, но и в клетках эукариот. Она обнаружена и у млекопитающих, для которых получены данные о том, что пострепликативные бреши могут заполняться не за счет рекомбинации, а за счет синтеза ДНК de novo. Уже упоминалось о том, что один из типов пигментной ксеродермы у человека (ХРУаг) связан с блоком пострепликативной репарации.

репарация ДНК только на примере восстановления структуры молекул, облученных ультрафиолетовым светом. ДНК, поврежденная ионизирующим излучением, также может быть восстановлена системами репарации. При этом устраняются однонитевые и двунитевые разрывы. Многие этапы восстановления ДНК после действия ультрафиолетового света и ионизирующих излучений одинаковы, однако есть и существенные различия, как, например, при устранении двунитевых разрывов.