Адаптации растений и животных к жизни в горах: Большое значение для жизни организмов в горах имеют степень расчленения, крутизна и экспозиционные различия склонов...
Своеобразие русской архитектуры: Основной материал – дерево – быстрота постройки, но недолговечность и необходимость деления...
Топ:
Процедура выполнения команд. Рабочий цикл процессора: Функционирование процессора в основном состоит из повторяющихся рабочих циклов, каждый из которых соответствует...
Комплексной системы оценки состояния охраны труда на производственном объекте (КСОТ-П): Цели и задачи Комплексной системы оценки состояния охраны труда и определению факторов рисков по охране труда...
Интересное:
Средства для ингаляционного наркоза: Наркоз наступает в результате вдыхания (ингаляции) средств, которое осуществляют или с помощью маски...
Как мы говорим и как мы слушаем: общение можно сравнить с огромным зонтиком, под которым скрыто все...
Наиболее распространенные виды рака: Раковая опухоль — это самостоятельное новообразование, которое может возникнуть и от повышенного давления...
Дисциплины:
2017-06-04 | 521 |
5.00
из
|
Заказать работу |
|
|
Цель занятия
Ознакомиться с методом получения первично трипсинизированной культуры клеток из тканей куриного эмбриона.
Оборудование и материалы
Куриные эмбрионы 9-12 дневной инкубации, чашки Петри, колбочки по 100 мл, фильтр марлевый, центрифужные пробирки, пробирки стерильные с резиновыми пробками, пипетки, воронки, трипсин, среда 199, раствор Хенкса, центрифуга, магнитные мешалки, магнитики, камеры Горяева, микроскопы, лед, овоскоп, мультимедийное оборудование, презентации MS Office Power Point по теме занятия.
Методика проведения занятия и методические указания по теме
Объяснение преподавателя
Метод культуры клеток заключается в том, что от убитого животного как можно быстрее после клинической смерти берут ткань или клетки и до наступления биологической смерти помещают их в соответствующие питательные среды и условия, обеспечивающие поддержание процессов жизнедеятельности. Наряду с множеством других преимуществ метод культуры тканей относительно дешев и поэтому может быть использован массово.
МЕТОД ТРИПСИНИЗАЦИИ
Культуры клеток из куриных эмбрионов методом трипсинизации готовят по следующей методике:
1. Подготовка куриных эмбрионов
а) овоскопирование
б) дезинфекция
в) извлечение, измельчение
г) промывание в растворе Хенкса.
2. Трипсинизацию проводят на магнитной мешалке в течение 10 минут подогретым до 35°С 0,25% раствором трипсина. Колбу помещают на тающий лед. Оставшиеся кусочки заливают новой порцией трипсина и трипсинизируют до истощения ткани.
3. Отделение клеток от трипсина.
Взвесь клеток в трипсине центрифугируют 10 минут при 1000 об/мин. Клеточный осадок ресуспендируют в небольшом количестве ростовой питательной среды.
|
4. Подсчет клеток.
Определяют количество клеток в 1 мл суспензии в камере Горяева. Считают клетки в 10 больших квадратах, среднее умножают на 22 000. Подсчет клеток необходим для того, чтобы получить хороший монослой. Для клеток куриного эмбриона оптимальная доза 250-500 тысяч клеток в 1 мл суспензии.
5. Посев клеток.
Вносят в каждую пробирку по 1 мл клеточной суспензии в ростовой среде. Пробирки закрывают резиновыми пробками, помещают на подставку под углом 5-7° и ставят в термостат при +37°.
Рост клеток будет заметен через 12-14 часов после посева, но хороший монослой образуется только через 2-3 дня. Ежедневно культуры просматривают под малым увеличением микроскопа для определения характера роста.
Метод холодной трипсинизации (рис. 29) используют для диспергирования тканей почек, полученных от поросят, телят, ягнят, кроликов, собак, хомяков, а также почек взрослых животных и других тканей. Метод включает следующие этапы:
а) корковый слой почки срезают и измельчают на кусочки размером 2 – 5 мм, ткань многократно (3–4 раза) промывают раствором Хенкса до полного освобождения от эритроцитов;
б) отмытые кусочки ткани переносят в трипсинизационную колбу и добавляют 0,25%-ный раствор трипсина, в котором перемешивают ткань 10 – 30 мин. После осаждения кусочков ткани надосадочную жидкость сливают и выбрасывают;
в) в колбу добавляют свежий раствор трипсина и помещают ее на магнитную мешалку. Скорость вращения регулируют так, чтобы не было разбрызгивания и вспенивания жидкости. Перемешивание продолжают в течение ночи (12–16 ч.) при 4-6 °С;
г) утром суспензию фильтруют через 2 – 3 слоя марли или сетку из нержавеющей стали в центрифужные флаконы;
д) клетки осаждают центрифугированием при 400 –600 об/мин 20 – 30 мин. Трипсин удаляют;
е) осадок клеток промывают в ростовой среде центрифугированием. Отмытые клетки ресуспендируют в ростовой среде, определяют концентрацию, доводят ее до посевной и разливают суспензию клеток в сосуды для культивирования.
|
Рисунок 29 - Последовательность приготовления почечной культуры клеток.
1 – измельчение коркового слоя; 2 – трипсинизация; 3 – осаждение диспергированных клеток центрифугированием, 4 – подсчет живых клеток в гемоцитометре; 5 – диспергирование клеток в среде выращивания, во флаконах Ру; 6 – снятие первичного монослоя культуры клеток с помощью трипсиноверсеновой смеси, процедура повторного осаждения и подсчета клеток; 7 – суспендирование клеток в среде роста, розлив по пробиркам и инкубация их в стационарных условиях до заражения вирусом
|
|
Типы сооружений для обработки осадков: Септиками называются сооружения, в которых одновременно происходят осветление сточной жидкости...
Механическое удерживание земляных масс: Механическое удерживание земляных масс на склоне обеспечивают контрфорсными сооружениями различных конструкций...
Типы оградительных сооружений в морском порту: По расположению оградительных сооружений в плане различают волноломы, обе оконечности...
Семя – орган полового размножения и расселения растений: наружи у семян имеется плотный покров – кожура...
© cyberpedia.su 2017-2024 - Не является автором материалов. Исключительное право сохранено за автором текста.
Если вы не хотите, чтобы данный материал был у нас на сайте, перейдите по ссылке: Нарушение авторских прав. Мы поможем в написании вашей работы!