Число таких доз вируса в единице объема материала и будет выражать титр вируса в этом материале.

 

Таблица 6 - Виды единиц количества вирусов при определении по 50 %-ному инфекционному действию

Тест-объекты	Виды инфекционного действия вирусов	Единицы количества вирусов
названия единиц	сокращение обозначения
Лабораторные	Гибель	50%-ная летальная	ЛД50
животные		доза
То же	Клинические симп-	50%-ная инфекци-	ИД50
	томы или патоло-	онная доза
	гоанатомические
	изменения
Куриные эмбри-	Гибель	50%-ная эмбриональ-	ЭЛД50
оны		ная летальная
		доза
То же	Патологоанатоми-	50%-ная эмбриональ-	ЭИД50
	ческие изменения	ная инфекционная
		доза
Культуры клеток	Цитопатический	50%-ная цитопати-	ЦПД50
	эффект	ческая доза

 

В качестве тест-объектов в лабораториях обычно используют белых мышей, куриные эмбрионы и культуры клеток, у которых инфекционное действие вируса может проявляться гибелью, клиническими симптомами, патологоанатомическими изменениями и цитопатическим эффектом. Для каждого вируса подбирают чувствительный к нему тест-объект и форму учета его инфекционного действия, по которой оценивают эффект заражения. В зависимости от вида тест-объекта и формы проявления инфекционного действия ЭД₅₀ принимает один из следующих видов, приведенных в таблице 6.

Иначе говоря:

1 ЛД₅₀—это доза вируса, убивающая 50 % лабораторных животных (обычно белых мышей);

1 ИД₅₀—доза вируса, вызывающая клинические симптомы или патологоанатомические изменения у 50 % зараженных лабораторных животных;

1 ЭЛД — доза вируса, убивающая 50 % куриных эмбрионов;

1 ЭИД₅₀—доза вируса, вызывающая патологоанатомические изменения у 50 % зараженных куриных эмбрионов;

1 ЦПД₅₀— доза вируса, вызывающая цитопатический эффект у 50 % зараженных культур клеток (обычно пробирок с культурами клеток).

Количество ЭД₅₀ (ЛД₅₀, ИД ЭЛД₅₀, ЭИД₅₀ или ЦПД₅₀) вируса, содержащееся в единице объема вируссодержащего материала, и будет выражением титра (Т) вируса в этом материале. Например, Т=10^3,48 ЦПД₅₀/0,1 мл означает, что в каждой 0,1 мл вируссодержащего материала содержится 10³'⁴⁸ доз вируса (т. е. более 1000, но менее 10 000, а именно 10^3,48=3020), каждая из которых способна вызвать цитопатический эффект в 50 % пробирок с культурой клеток.

Названные единицы 50%-ного инфекционного действия вируса (ЛД₅₀, ИД₅₀, ЭЛД₅₀, ЭИД₅₀, ЦПД₅₀) используются в случаях оценки инфекционного действия вируса со статистически оцениваемым эффектом, имеющим место, когда учет инфекционного действия вируса ведется по летальному действию, клиническим симптомам, патологоанатомическим изменениям или цитопатическому действию.

Титрование вирусов по 50 %-ному инфекционному действию — наиболее универсальный прием, пригодный для титрования практически любого вируса, если подобрать чувствительную к нему живую систему (текст-объект). Однако этот метод титрования вирусов довольно трудоемкий, длительный и требует статистических расчетов.

Задача определения титра вируса в единицах 50 %-ного инфекционного действия (ЛД₅₀, ИД₅₀, ЭЛД₅₀, ЭИД₅₀, ЦПД₅₀) сводится к тому, чтобы найти такое разведение испытуемого вируссодержащего материала, в объеме заражающей дозы которого содержалась бы одна ЭД₅₀, а затем рассчитать, сколько таких единиц вируса содержится в таком же объеме вируссодержащего материала, что и будет показателем титра вируса в этом материале.

Чтобы решить эту задачу, сначала из исследуемого вируссодержащего материала готовят ряд последовательных 10-кратных разведений. 10-кратные разведения берут по двум причинам:

во-первых, как видно из графика зависимости инфекционного эффекта от дозы вируса (рис. 36), кривая этой зависимости вблизи точки, соответствующей ЭД₅₀, на значительном отрезке приближается к прямой.

 

Рисунок 36 - График зависимости инфекционного эффекта от дозы вируса

 

Это означает, что в определенных пределах, центр которых в точке ЭД₅₀, между логарифмом дозы (разведения) вируса и инфекционным эффектом существует прямолинейная зависимость, т. е. величина инфекционного эффекта пропорциональна логарифму дозы вируса (или его разведения), в области малых и особенно больших доз эта зависимость нарушается;

во-вторых, при 10-кратном разведении облегчаются последующие расчеты.

Одинаковыми объемами каждого из 10-кратных разведений исследуемого вируссодержащего материала заражают равные группы чувствительных к данному вирусу живых тест-объектов (мышей, куриных эмбрионов или культур клеток). При этом в каждой группе должно быть не менее 4 – 6 тест-объектов, так как при меньшем количестве статистически рассчитываемая величина титра вируса будет иметь слишком большую погрешность (статистическая величина тем точнее, чем на большем количестве исходных данных она основана).

После заражения учитывают результат действия вируса (гибель, клинические симптомы, патологоанатомические изменения или ЦПЭ) на зараженные объекты и определяют, в каком разведении вирус проявил свое действие на 50 % чувствительных объектов. Разведение, дающее 50 %-ный эффект, рассчитывают методом прямолинейной интерполяции. Когда такое разведение нашли, то считают, что в заражающем объеме вируса, разведенного в найденное (соответствующее 50 %-ному эффекту) число раз, содержится 1 ЭД₅₀. В таком же объеме исходного (неразведенного) вируссодержащего материала таких доз (ЭД₅₀) содержится больше во столько раз, во сколько был разведен материал, давший 1 ЭД₅₀. Затем пересчитывают, сколько таких единиц 50 %-ного инфекционного действия вируса содержится в единице объема (мл) вируссодержащего материала, что и будет выражением титра вируса в данном материале.

 

Задания

1. Рассчитать титр вируса в единицах 50%-ного инфекционного действия по предложенным фактическим данным.

2. Определить титр вируса ньюкаслской болезни в аллантоисной жидкости в единицах гемагглютинирующего действия.

Самостоятельная работа студентов

а) подготовка панелей, пипеток и материала; б) получение последовательных 2-кратных разведений вируса по 0,5 мл или по 0,2 мл; в) добавление 1 %-ной суспензии эритроцитов; г) учет результатов и их интерпретация. Во время экспозиции переписывание в тетрадь (с доски или таблицы) схемы титрования антител к вирусу ньюкаслской болезни в РТГА.

Подведение итогов занятия

Задание к следующему занятию

Контрольные вопросы

1. Что такое титр вируса?

2. Каковы единицы измерения количества вируса?

3. Каков принцип определения титра вируса в БОЕ и ООЕ?

4. В чем принцип определения титра вируса в единицах 50 %-ного инфекционного действия?

5. Какова методика расчета титра вируса в единицах 50 %-ного инфекционного действия?

6. В чем принцип определения титра вируса в ГАЕ?

7. Каковы достоинства и недостатки разных методов титрования вирусов?

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Ветеринарная вирусология: учебник для вузов / Р. В. Белоусова, Э. А. Преображенская, И. В. Третьякова; под ред. Р. В. Белоусовой. - М.: КолосС, 2007. - 424 с.

2. Ветеринарная вирусология: [учебник для вузов] / Р. Г. Госманов, Н. М. Колычев. - 2-е изд., перераб. и доп. - М.: КолосС, 2006. - 304 с.,

3. Ветеринарная вирусология / В. А Сергеев [и др.].– М., 2002. – 217 с.

4. В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, Н.В. Фомина Ветеринарная вирусология.-Изд.2-е. – М.: Агропромиздат, 1991

5. Практикум по ветеринарной вирусологии: учеб. пособие для вузов / Н. И. Троценко, Р. В. Белоусова, Э. А. Преображенская. - 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Колос, 2006. - 273 с.

6. Аграрная наука. – М. «Аграрная наука», 2005-2016.

7. Журнал Аграрная наука Евро-Северо-Востока. – Новосибирск, С-В НМЦ Россельхозакадемии, 2005-2015.

8. Журнал Вестник ветеринарии (Vestnik veterinarii). – Ставрополь, «Энтропос». 2005-2016.

9. Журнал Вестник Бурятской государственной сельскохозяйственной академии им. В.Р. Филиппова. – Улан-Удэ. Изд-во «Вестника БГСХА им В.Р. Филиппова». 2006-2016.

10. Журнал Вестник Алтайского государственного аграрного университета. – Барнаул. Изд-во «Вестника Алтайского государственного аграрного университета». 2007-2016.

11. Журнал Вестник Воронежского государственного аграрного университета. – Воронеж, Изд-во Воронежского ГАУ. 2009-2016.

12. Журнал Вестник ИрГСХА. – Иркутск. Изд-во ФГОУ ВПО «Иркутская государственная сельскохозяйственная академия». 2006-2016.

13. Журнал Вестник КрасГАУ. – Красноярск. Изд-во ФГОУ ВПО «КрасГАУ». 2005-2016.

14. Журнал Вестник Курской государственной сельскохозяйственной академии. – изд-во ФГОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова». 2009-2016.

15. Журнал Вестник ОрелГАУ. – Изд-во ФГОУ ВПО Орёл ГАУ. 2007-2016.

16. Журнал Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова. – Изд-во ФГОУ ВПО СГАУ им. Н.И. Вавилова. 2002-2016.

17. Журнал Ветеринарная медицина. – М. ООО «Агровет». 2005-2016.

18. Журнал Ветеринарная практика. – СПб. 2008-2016.

19. Журнал Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. – СПб. Изд-во. – СПбГАВМ. 2008-2016.

 

Содержание

Введение…………………………………………………………….

Тема 1. Правила работы с вируссодержащими материалами. Устройство вирусологической лаборатории……………………..

1.1 Техника безопасности и правила работы с вируссодержащим материалом………………………………………………………….

1.2 Требования к рабочим помещениям и обеспечение условий работы………………………………………………………………..

1.3 Хранение вирусов и других материалов, учет и этикетировка их в лаборатории……………………………………………………….

1.4 Основные методы консервации вирусов…………………………

Тема 2. Получение, транспортировка и подготовка патологического материала для вирусологических исследований………………..

1.1 Получение и обработка патологического материала…………..

1.2 Получение патологоанатомического материала………………..

1.3 Получение проб для гистологического исследования………….

1.4 Транспортировка и хранение проб……………………………….

Тема 3. Индикация вирусов в патологическом материале по обнаружению вирионов и вирусных телец-включений………...

3.1 Методы прямого обнаружения вируса в исследуемом материале…………………………………………………………...

3.2 Методы окраски вирионов………………………………………...

3.3 Устройство и принципы работы электронного и люминесцентного микроскопов…………………………………..

3.4 Методы подготовки препаратов…………………………………..

Тема 4. Использование лабораторных животных в диагностических исследованиях. Цели использования животных в вирусологии..

4.1 Виды лабораторных животных……………………………………

4.2 Цели использования лабораторных животных………………….

4.3 Требования к лабораторным животным…………………………

4.4 Содержание лабораторных животных……………………………

4.5 Техника безопасности при работе с лабораторными животными………………………………………………………….

4.6 Метка лабораторных животных…………………………………..

Тема 5. Использование лабораторных животных в диагностических исследованиях. Биопроба………………………………………….

5.1 Методы экспериментального заражения лабораторных животных…………………………………………………………...

5.2 Способы фиксации и техника заражения лабораторных животных…………………………………………………………...

5.3 Содержание лабораторных животных после заражения……….

Тема 6. Использование лабораторных животных в диагностических исследованиях. Вскрытие лабораторных животных……………

6.1 Признаки размножения вируса в организме лабораторного животного…………………………………………………………...

6.2 Взятие материала от лабораторных животных…………………..

6.3 Вскрытие лабораторных животных………………………………

Тема 7. Использование в вирусологии куриных эмбрионов. Культивирование вирусов на куриных эмбрионах………………

7.1 Достоинства и недостатки куриных эмбрионов как биологических объектах…………………………………………..

7.2 Цели использования куриных эмбрионов………………………..

7.3 Требования к куриным эмбрионам……………………………….

7.4 Строение куриного эмбриона……………………………………..

7.5 Подготовка куриных эмбрионов к заражению…………………..

Тема 8. Использование в вирусологии куриных эмбрионов. Заражение куриных эмбрионов………………………………………………..

8.1 Методы экспериментального заражения куриных эмбрионов...

8.1.1 Заражение в аллантоисную полость……………………….

8.1.2 Заражение на хорион-аллантоисную оболочку…………….

8.1.3 Заражение в желточный мешок…………………………….

8.1.4 Заражение в амниотическую полость………………………

8.1.5 Заражение в кровеносные сосуды ХАО……………………

8.1.6 Заражение в тело зародыша………………………………...

8.2 Накопление вируса в курином эмбрионе………………………..

8.3 Деэмбринированные яйца…………………………………………

Тема 9. Использование в вирусологии куриных эмбрионов. Вскрытие куриного эмбриона и получение вируссодержащего материала. Индикация вирусов………………………………………………...

9.1 Признаки размножения вируса в куриных эмбрионах………….

9.2 Определение гемагглютинирующих свойств вирусов…………..

9.3 Вскрытие куриных эмбрионов…………………………………….

Тема 10. Использование в вирусологии культур клеток. Типы культур клеток……………………………………………………………….

10.1 Типы культур клеток………………………………………………

10.2 Хранение культур клеток………………………………………….

10.3 Контаминация культур клеток…………………………………….

10.4 Растворы…………………………………………………………….

10.5 Питательные среды………………………………………………...

10.6 Посуда………………………………………………………………

Тема 11. Использование в вирусологии культур клеток. Культивирование вирусов в культуре клеток……………………

11.1 Метод трипсинизации……………………………………………..

11.2 Номенклатура культур тканей и клеток………………………….

Тема 12. Использование в вирусологии культур клеток. Заражение культур клеток. Индикация вируса……………………………….

12.1 Подбор культур клеток…………………………………………….

12.2 Заражение клеток…………………………………………………..

12.3 Культивирование вируса………………………………………….

12.4 Индикация (обнаружение) вируса в культуре клеток………….

Тема 13. Титрование антител к вирусам в реакции торможения (задержки) гемагглютинации (РТГА, РЗГА)……………………

13.1 Принципы серологических реакций……………………………..

13.2 Принцип РТГА……………………………………………………

Тема 14. Использование в вирусологии реакции непрямой гемагглютинации…………………………………………………

14.1 Методика постановки РНГА…………………………………….

14.2 Главный опыт РНГА……………………………………………..

Тема 15. Использование в вирусологии реакции диффузной преципитации в агаровом геле…………………………………...

15.1 Принцип реакции преципитации………………………………...

15.2 Основные задачи РДП……………………………………………

15.3 Постановка РДП…………………………………………………..

Тема16. Титрование вирусов………………………………………………

Библиографический список………………………………………

УЧЕБНОЕ ИЗДАНИЕ

Фирсов Григорий Михайлович

ВИРУСОЛОГИЯ

Учебное пособие

 

 

 

В авторской редакции

 

Компьютерная верстка

 

 

Подписано в печать. Формат 60х84 ^1/16.

Усл. печ. л.7,44. Тираж 100. Заказ.

ИПК ФГБОУ ВО Волгоградский ГАУ «Нива».

400002, Волгоград, пр. Университетский, 26.