Номенклатура культур тканей и клеток

 

В1966 г. предложена унифицирован­ная терминология для тканевых культур животных. Основные положения ее при­водятся ниже.

Культура тканей (tissue culture; Gewebekultur) – сборное понятие, обознача­ющее систему, в которой клетки, ткани или органы сохраняют жизнеспособ­ность или способность размножаться in vitro более 24 ч. В зависимости от вида биологического объекта различают; культуру клеток (cell culture; Zellkultur) – термин, который обозначает рост клеток in vitro и включает в себя также рост единичных клеток (клетки в культуре не образуют ткань); культуру тканей или органов (tissue or organ culture; Gewebe oder organ Kultur) – термин, который обозначает поддержание роста тканей, зачатков органов или их частей in vitro при сохранении их дифференцировки, структуры и (или) функции.

Эксплантат (explant; Explantat) – вырезанный кусок ткани или органа, ис­пользуемый для культуры in vitro.

Однослойная культура клеток, монослой (monolayer; einschkhtiger Zellrasen) – клетки, растущие в один слой на определенной поверхности. Клеточный штамм (cell strain, Zellstamm) выводится из первичной культуры или из клеточной линии путем селекции или клонирования клеток со специфи­ческими свойствами (маркерами) Эти маркеры должны сохраняться во время дальнейшего культивирования. При описании штамма необходимо ха­рактеризовать его свойства, например наличие определенного хромосомного набора, специфических антигенов, устойчивости к определенному вирусу.

Подштамм (substrain, Unterstamm) можно получить из штамма путем изоля­ции единичной клетки или группы клеток, обладающих свойствами, которыми не обладают остальные клетки штамма

Клон (clone, Klon) – популяция клеток, полученная путем деления (митоза) одной клетки Клон не всегда однороден и не должен быть таким, поэтому нельзя использовать термины «клон» или «клонированный» для обозначения однород­ной популяции клеток.

Клонированный штамм или линия (clone strain or line, geklonter Stamm oder geklonte Lime) – штамм или линия, выведенные из одного клона.

Время генерации клеток (cell generation time; Zellgenerationszeit) – интервал между последующими делениями клеток. Лучше всего определять с помощью микрофотографии. Термин этот не идентичен термину «время удвоения популя­ции».

Время удвоения популяции (population doubling time; Verdopplungszeit). Термин касается всей популяции и определяет время, за которое количество клеток воз­растает, например с 1 х 10⁶ до 2 х 10⁶.

Абсолютная эффективность посева (absolute plating efficiency; absolute Aussaateffektivitat) – процент единичных клеток, которые после внесения в сис­тему для выращивания (посев) образуют колонии. Обязательно всегда сообщать общее число введенных клеток, тип посуды и условия (род питательной среды, температура, открытая или закрытая система, атмосфера, С0₂ и т. д.).

Относительная эффективность посева (relative plating efficiency; relative Aussaateffektivitat) – процент посеянных клеток, образующих колонии по отно­шению к контролю, в котором за 100 % принимается абсолютная эффектив­ность посева. Необходимо всегда сообщать общее число введенных клеток, ус­ловия выращивания и абсолютную эффективность посева в контроле.

Самостоятельная работа студентов

а) изучение техники получения первичных трипсинизированных культур по методике;

б) получение первично-трипсинизированных культур клеток из куриных эмбрионов.

Подведение итогов занятия

Задание к следующему занятию

Контрольные вопросы

1. Методика получения первично трипсинизированных культур клеток по методу Дюльбекко и Фогт.

2. Сущность трипсинизации, техника проведения.

3. Для чего посуду закрывают резиновыми пробками.

.

ТЕМА 12. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ВИРУСОЛОГИИ КУЛЬТУР КЛЕТОК. ЗАРАЖЕНИЕ КУЛЬТУР КЛЕТОК. ИНДИКАЦИЯ ВИРУСА

Цель занятия

Ознакомление с методикой заражения клеточных культур вируса. Изучение методов индикации вирусов в культурах клеток.

Оборудование и материалы

Иикроскопы, культуры клеток с предыдущего занятия, фиксированные культуры клеток, фотографии, мультимедийное оборудование, презентации MS Office Power Point по теме занятия.

Методика проведения занятия и методические указания по теме

Объяснение преподавателя

ПОДБОР КУЛЬТУР КЛЕТОК

 

Не всякая клетка чувствительна к любому вирусу. Вирус к первичной культуре обычно успешно адаптируется при условии, если культура получена из органов животного, естественно восприимчивого к данному вирусу. Однако адаптация вируса к перевиваемым клеткам более сложна, а в ряде случаев неосуществима. Для культивирования некоторых вирусов до сих пор неизвестно ни одной клеточной системы. Для культивирования вируса используют обычно молодые клетки, т. е. в первый день формирования монослоя, а в некоторых случаях (для парвовирусов свиней) клетки заражают при их посеве, так как вирус интенсивно размножается при наличии делящихся клеток (когда они находятся в стадии логарифмического роста).

ЗАРАЖЕНИЕ КЛЕТОК

 

Для этого отбирают пробирки (или матрасы) со сплошным клеточным монослоем, просматривая их под малым увеличением микроскопа. Ростовую питательную среду сливают, клетки 1–2 раза промывают раствором Хенкса, чтобы удалить сывороточные антитела и ингибиторы. В каждую пробирку вносят по 0,1–0,2 мл вируссодержащего материала и покачиванием распределяют его равномерно по слою клеток. В таком виде пробирки (матрасы) оставляют от 1 до 2 ч при 22 или 37 °С для адсорбции вируса на поверхности клеток. Затем вируссодержащий материал удаляют из пробирок (матрасов) и наливают поддерживающую среду (в пробирку 1–2 мл, в матрасы около 10 % его объема). При выделении вируса из патологического материала некоторые пробы (фекалий и др.) могут оказывать токсическое действие на клетки, поэтому после адсорбции вируса монослой клеток отмывают 1–2 раза раствором Хенкса (или питательной средой) и затем наливают поддерживающую среду.

Все пробирки выдерживают монослоем вниз 1-2 часа при комнатной температуре (для адсорбции вирусов на клетках).

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСА

 

Пробирки (матрасы) закрывают герметически резиновыми пробками и ставят на инкубацию в термостат при 37 °С. Наиболее широко применяют стационарное инкубирование. При этом матрасы кладут в горизонтальном положении, пробирки – под углом 5° так, чтобы монослой клеток оказался под питательной средой (чертой вверх). В ряде лабораторий зараженные культуры клеток инкубируют на вращающейся системе – роллерах. Используя этот метод, удается получать большой выход вируса, имеющего более высокий инфекционный титр, чем при стационарном культивировании.

На следующий день заменяют питательную среду. При необходимости ставят контроль на токсичность вируссодержащей суспензии.

Для каждой пробы материала обычно используют не менее 4–10 пробирок с культурой клеток. Для контроля оставляют 4–6 пробирок с незараженной культурой клеток, в которых заменяют ростовую среду на поддерживающую.

В культурах клеток, зараженных вирусом, питательную среду можно не менять в течение 7 дней, а рН среды (6,9–7,4) поддерживать с помощью 7,5 %-ного раствора бикарбоната натрия. При более длительном культивировании инфицированных клеток (аденовирусы и др.) среду меняют.

Все пробирки (матрасы) после заражения клеток ежедневно исследуют под малым увеличением микроскопа, сравнивая культуры клеток, зараженные вирусом, с контрольными.

В термостате адсорбировавшиеся на клетках вирусные частицы проникают внутрь их, и начинается их репродукция. Новые вирусные частицы покидают (полностью или частично) клетки, в которых они образовались, проникают в непораженные клетки, репродуцируются в них, переходят в новые клетки и поражают их. Так продолжается до тех пор, пока есть живые неповрежденные клетки. В результате этого процесса практически все клетки в матрасе или пробирке поражаются вирусом, хотя абсолютно все почти никогда не поражаются.

Вирус накапливается в основном в культуральном жидкости, но часть вирионов может оставаться и внутри не разрушенных вирусом клеток. Чтобы оставшийся в клетках вирус освободить, клетки тщательно разрушают или многократным замораживанием – оттаиванием (2–3 раза), или с помощью ультразвука.