Тема 9. Использование в вирусологии куриных эмбрионов. Вскрытие куриного эмбриона и получение вируссодержащего материала. Индикация вирусов

 

Цель занятия

Научить студентов вскрывать куриные эмбрионы, отбирать патматериал, проводить индикацию вируса в зараженных куриных эмбрионах.

Оборудование и материалы

Зараженные куриные эмбрионы, инструменты для вскрытия в стерилизаторе, пипетки с грушами, подставки для куриных эмбрионов, спиртовки, чашки Петри, физраствор, эритроциты (1-2 % взвесь), предметные стекла, овоскоп, таблицы, схемы, мультимедийное оборудование, презентации MS Office Power Point по теме занятия.

Методика проведения занятия и методические указания по теме

Объяснение преподавателя

Вскрывают куриные эмбрионы с целью обнаружения признаков размножения в них вирусов и получения вируссодержащего материала. Последнее требует соблюдения правил асептики при вскрытии.

ПРИЗНАКИ РАЗМНОЖЕНИЯ ВИРУСА В КУРИНЫХ ЭМБРИОНАХ

 

Показателем заражения эмбриона вирусом может служить его гибель в характерные для данного вируса сроки. Другой признак размножения вируса – патологоанатомические изменения, появляющиеся в различных структурах эмбриона. Так, ХАО может быть отечной, иметь кровоизлияния, узелки, или, как их называют, оспины. Такого рода поражения наблюдаются при заражении куриных эмбрионов вирусами оспы птиц, инфекционного ларинготрахеита птиц, болезни Ауески и некоторыми другими. При этом размер и морфология оспин заметно различаются при размножении разных вирусов. Сам зародыш может отставать в росте и развитии от незараженных, т. е. проявлять феномен карликовости. Тело его может быть в разной степени обезвожено или мумифицировано, шея характерно перекручена. Названные признаки характерны для инфекционного бронхита кур). Кожа зародыша может быть гиперемирована, с кровоизлияниями. Внутренние органы также могут иметь признаки размножения вируса. Например, набухшая желто-зеленого или темно-зеленого цвета печень куриного эмбриона – признак размножения в нем вируса гепатита утят.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕМАГГЛЮТИНИРУЮЩИХ СВОЙСТВ ВИРУСОВ

Встречаются вирусы (например, штамм В, вируса ньюкаслской болезни), которые, размножаясь в куриных эмбрионах, не вызывают ни их гибели, ни патологоанатомических изменений. Обнаружить такой вирус можно лишь в том случае, если он обладает способностью агглютинировать эритроциты, т. е. с помощью реакции гемагглютинации (РГА) Явление гемагглютинации представляет собой соединение эритроцитов в хлопья при добавлении к ним суспензии гемагглютинирующего вируса.

Гемагглютинирующими свойствами обладают те вирусы, вирионы которых имеют на поверхности рецепторы, способные взаимодействовать с рецепторами оболочек эритроцитов. Такие вирионы адсорбируются на поверхности эритроцитов. Адсорбция одного вириона одновременно на двух эритроцитах ведет к тому, что последние оказываются соединенными между собой, а адсорбировавшийся вирион играет роль мостика между ними.

Образованием таких мостиков между многими эритроцитами и объясняется склеивание эритроцитов в хлопья.

Образование хлопьев, видимых невооруженным глазом, можно наблюдать при смешивании капли суспензии вируса с каплей отмытых эритроцитов на плоской поверхности (стекла, керамики и др.). При смешивании суспензии эритроцитов и вируса в пробирке хлопья эритроцитов оседают ровным слоем на дно в форме так называемого зонтика.

РГА используют для обнаружения и титрования вирусов. Хлопья эритроцитов появляются через 5–10 мин после смешивания капли вируссодержащей жидкости и капли взвеси эритроцитов (рис. 23). Положительная гемагглютинация не только указывает на присутствие вируса, но и выявляет его гемагглютинирующую активность с определенным видом эритроцитов, что может служить вспомогательным диагностическим признаком.

Рисунок 23 - Капельная реакция агглютинации а– гомогенная взвесь эритроцитов сразу после смешивания их с вируссодержащей жидкостью; б – хлопья агглютинированных эритроцитов в той же смеси через 10 мин

 

ВСКРЫТИЕ КУРИНЫХ ЭМБРИОНОВ

 

В зависимости от того, каким вирусом был заражен эмбрион (а значит, в какой структуре он накопился соответственно тропизму), вируссодержащим материалом могут служить ХАО, ткани зародыша, желточный мешок (его стенки), а также аллантоисная и амниотическая жидкости. В последнем случае выделение вируса наиболее удобно, так как экстраэмбриональные (аллантоисная, амниотическая) жидкости представляют, по существу, готовую суспензию вируса.

Перед вскрытием скорлупу эмбриона обрабатывают йодированным спиртом (иногда еще фламбируют). Вскрытие производят в боксе, пользуясь стерильными инструментами и посудой. Скорлупу срезают над той воздушной камерой (естественной или искусственной), через которую заражали. При этом яйцо держат под некоторым углом, чтобы скорлупа не упала внутрь. Ножницы не должны касаться и повреждать лежащую под воздушной камерой оболочку, для этого срез должен проходить несколько выше границы воздушной камеры.

Обнажившуюся ХАО осматривают, приподнимая ее пинцетом с целью установления в ней патологоанатомических изменений. Часть ХАО, на которую был нанесен вируссодержащий материал, имеет обычно наиболее выраженные изменения. Для более тщательного осмотра ее и взятия этой части приподнимают пинцетом ХАО в этом месте и срезают ножницами возможно больше. Для осмотра и взятия всей ХАО удаляют зародыш, желточный мешок и белок, а хорионаллантоисную оболочку отслаивают от внутренней поверхности скорлупы, извлекают и переносят в стерильную чашку Петри с физраствором. Оболочку отполаскивают, а затем двумя пинцетами расправляют так, чтобы она лежала в один слой и могла быть осмотрена по всей поверхности. Для того чтобы патологоанатомические изменения оболочки были видны более отчетливо, под чашку Петри подкладывают лист черной бумаги.

Аллантоисную жидкость в количестве до 10 мл отсасывают пипеткой, которой прокалывают подскорлупную оболочку и ХАО над телом зародыша (рис. 24). Такое направление пипетки предотвращает случайный разрыв стенки желточного мешка и смешивание его содержимого с набираемой аллантоисной жидкостью.

Рисунок 24 - Отбор аллантоисной жидкости (по Николау и др.)

Рисунок 25 - Обор амниотической жидкости (по Николау и др.)

 

Амниотической жидкости удается отсосать до 1 мл. Для этого после удаления аллантоисной жидкости пипетку вводят в амнион между головой и телом зародыша под его шеей (рис. 25).

Для получения стенки желточного мешка как вируссодержащего материала желток извлекают на чашку Петри, стенку его разрезают ножницами и отполаскивают от содержимого в физиологическом растворе. Тело зародыша извлекают, удерживая его за шею (рис. 26).

При вскрытии куриных эмбрионов ставят бактериологический контроль вируссодержащего материала посевом на МПБ, МПА, МППБ и среду Сабуро. Вируссодержащий материал хранят при минус 25 °С и ниже.

Рисунок 26 - Извлечение тела зародыша

 

Задания

1. Подготовить куриные эмбрионы к заражению.

2. Заразить куриные эмбрионы вирусами ньюкаелской болезни и оспы голубей (кур).

3. Вскрыть зараженные куриные эмбрионы, получить ХАО и аллантоисную жидкость.

4. Поставить капельную РГА с аллантоисной жидкостью.

Самостоятельная работа студентов

а) подготовка рабочих мест и спецодежды к вскрытию куриных эмбрионов, зараженных на предыдущем занятии;

б) вскрытие куриных эмбрионов, зараженных вирусом ньюкаслской болезни, отсасывание аллантоисной и амниотической жидкостей, постановка капельной РГА;

в) вскрытие куриных эмбрионов, зараженных вирусом оспы, извлечение ХАО, подсчет и зарисовка оспин;

г) подготовка к обеззараживанию инструментов, эмбрионов, посуды.

Подведение итогов занятия

Задание к следующему занятию

Контрольные вопросы

1.Что вы знаете о методах индикации вирусов в куриных эмбрионах?

2.Какие способы получения вируссодержащего материала от куриных эмбрионов вы знаете?

3.Каковы гемагглютинирующие свойства вирусов и их использование? Каков механизм гемагглютинации?