Негенетические и генетические взаимодействия вирусов.

Как при естественном инфекционном процессе, так и в экспериментальных условиях клетка может быть заражена не одним, а несколькими вирусами. Поэтому при смешанной инфекции наблюдаются две различные формы взаимодействия:

между геномами вирусов (генетические взаимодействия) — рекомбинация, множественная реактивация, кросс-реактивация, пересортировка генов, гетерозиготность,транскапсидация;

между продуктами генов (негенетические взаимодействия) — комплементация, фенотипическое смешивание, негенетическая реактивация, интерференция.

Генетические взаимодействия вирусов. Рекомбинация, или обмен генами между организмами, может быть межгенная, т. е. обмен целыми генами, и внутригенная, т. е. обмен участками внутри одного гена.

Путем рекомбинации можно передавать ряд признаков: гемагглютинирующую активность; ингибиторо — и терморезистентность; патогенность для мышей; активность размножения в куриных эмбрионах; ферментативную, иммуногенную и цитопатоген- ную активности. Одни признаки (ингибиторорезистентность, гемагглютинирующая активность, инфекционность, иммунологическая активность) передаются регулярно, другие (терморезистентность, патогенность, ферментативная активность и ингибиторочувствительность) — нерегулярно.

Рекомбинанты вирусов позвоночных удается получить только при скрещивании близких по свойствам вирусов, принадлежащих к одному роду. Частота возникновения их широко варьирует и существенно зависит от используемой биологической системы (клетки, вирус), а также от того, какое наследственное свойство стремятся рекомбинировать. Рекомбинация с высокой частотой наблюдается у PHK-содержащих вирусов и у ДНК-содержащих вирусов, геном которых представлен двуспиральной ДНК.

В экспериментальных условиях гибридные формы можно получить одним из четырех способов:

1) при совместном культивировании двух жизнеспособных вирусов и введении их в чувствительную систему одновременно или в разное время.

2) при введении в чувствительную систему живого и инактивированного (УФ-лучи, нагревание) вируса.

3) при совместном культивировании вируса и вирусной нуклеиновой кислоты, выделенной из другого штамма.

4) в случаях одновременного введения в культуру клеток разных нуклеиновых кислот, соответствующих двум разновидностям вирусов.

Различают три вида рекомбинации.

1. Общая рекомбинация происходит между гомологичными последовательностями нуклеиновых кислот, обычно в процессе их синтеза.

2. Сайтспецифическая рекомбинация происходит между молекулами нуклеиновых кислот, имеющими гомологичные последовательности только на несколько нуклеотидов (15—31 нуклеотид.

3. Незаконная рекомбинация происходит между молекулами, не имеющими каких-либо сходных последовательностей нуклеотидов.

Во всех трех случаях под рекомбинацией понимают симметричный или асимметричный обмен участками между молекулами нуклеиновых кислот.

Множественная реактивация. Вид генетического взаимодействия, который наблюдается при заражении клетки несколькими вирионами с поврежденным геном. При этом функцию «пострадавшего» гена может выполнять вирус, у которого этот ген не поврежден. Этот феномен был вначале обнаружен на бактериофагах.

В основе множественной реактивации лежит кооперативный процесс: вирионы с поражением отдельных генов дополняют друг друга путем генетической рекомбинации, в результате репродуцируется исходный неповрежденный вирус.

Для множественной реактивации имеет значение:

-расстояние внутри клетки между вирионами, геном которых поврежден;

-характер используемой культуры клеток.

Эффективность процесса зависит от многих причин: степени повреждения генома вирионов, числа проникших в клетку вирионов, концентрации вирионов в определенных участках клетки, аутоинтерференции поврежденных вирионов.

Кросс-реактивация. Реактивация при скрещивании (или спасение маркера) — это феномен, сходный с множественной реактивацией, но отличный тем, что один из вирусов используют в нативном (неизмененном) виде, другой — инактивируют путем частичного разрушения генетического материала (действие УФ, температуры и др.). При этом наблюдаются два различных явления:

-реактивация (восстановление активности) инактивированного генома неповрежденным геномом вируса, т. е. сохраняются неповрежденные участки нуклеиновой кислоты инактивированного вируса;

-взаимная реактивация двух инактивированных геномов.

В результате могут возникать рекомбинанты со свойствами обоих использованных в опыте штаммов. Кросс-реактивация имеет место в тех случаях, когда инактивированный геном вводится в клетку до введения неповрежденного генома вируса или при их одновременном введении. Пересортировка генов. Вид генетического взаимодействия, который наблюдается среди вирусов с фрагментированным геном (рео-, арена-, бунья-, ортомиксовирусы). Образуются определенные группировки (констелляции, или созвездия) генов, которые в данной системе клеток более стойкие, и вирус более жизнеспособен. Образующиеся при этом гибридные формы вирусов называют реассортантами.

Чаще всего и интенсивнее пересортировка генов происходит с вирусами гриппа А (ортомиксовирусы). Гибридные формы вирусов гриппа получают при совместном культивировании вирусов с разными генами гемагглютинина и нейраминидазы, после чего из общего потомства путем нейтрализации соответствующих антигенов можно выделить интересующие варианты.

Гетерозиготность. Феномен, наблюдаемый при репродукции в клетке нескольких частиц вирусов, отличающихся наследственными признаками. В результате в клетке могут образовываться вирионы, содержащие полный геном одного родительского штамма и часть генома (или полный геном) другого вируса (диплоидные или полиплоидные вирионы). Образующиеся при этом гибридные формы вирусов называются гетерозиготы. В отличие от обычных гомозиготных частиц все потомство обладает одинаковыми свойствами.

Объединение генетического материала в одной вирусной частице не наследуется, но позволяет такому вириону дать потомство, в котором будет содержаться часть вирусных частиц со свойствами одного, а часть — другого родителя.

Транскапсидация. Феномен, наблюдаемый при репродукции в клетке нескольких неродственных вирусов. При этом часть чужеродного генетического материала, заключенного внутри капсида одного неродственного вируса, способна переноситься (в стабильной форме) в чувствительные к основному вирусу клетки.

Негенетические взаимодействия вирусов. Фенотипическое смешивание. Наблюдается при одновременной репродукции двух генетически различных вирусов; проявляется образованием вирионов с генотипом одного из исходных штаммов, но антигенными свойствами обоих вирусов. При данном виде взаимодействия объединяются только структурные белки вирусов, обмена информацией между их нуклеиновыми кислотами не происходит. Формы со смешанным фенотипом нейтрализуются сыворотками против обоих исходных штаммов, так как в оболочке полученных вирусов имеются структурные белки обоих родительских штаммов. Такие вирионы воспроизводят в первом поколении признаки того штамма, нуклеиновую кислоту которого они содержат.

Негенетическая реактивация. При таком виде взаимодействия инактивированный вирус А в результате денатурации структурных белков (депротеинизации) приобретает способность размножаться благодаря активности фермента другого родственного вируса Б. Катализатором может быть не только жизнеспособный вирус Б, но и вирус В, ДНК которого повреждена и не способна реплицироваться (воспроизводиться). Введение депротеинизирующего фермента в культуру клеток, которая инфицирована инактивированным вирусом, ведет к освобождению ДНК вирионов инактивированного вируса и запускает полноценный цикл репродукции.

Комплементация. Наблюдается в тех случаях, когда при мутации в геноме вируса возникают повреждения, и он лишается способности самостоятельной репродукции. Если в клетку проникают два дефектных штамма, у одного из которых повреждения локализованы в гене, ответственном за синтез ранних белков (ферментов), а у другого штамма — в гене, ответственном за синтез структурных белков, то каждый из них может взаимно использовать фермент, синтез которого индуцируется другим штаммом. В результате такой кооперации два дефектных вируса, не способных репродуцироваться поодиночке, при двойной инфекции проходят полный цикл репродукции. Отличие комплементации от генетической рекомбинации заключается в отсутствии обмена генетическим материалом.

Комплементация может быть:

-односторонняя, когда один вирус обеспечивает другого необходимыми для его репродукции продуктами. Стимулирующий репродукцию вирус называется «вирус-помощник», а вирус, репродуцирующийся только в присутствии помощника, — «вирус — сателлит»;

-двусторонняя, когда каждый из вирусов не способен к самостоятельной репродукции.

Этот вид взаимодействия широко распространен как между родственными, так и неродственными вирусами и тесно связан с дефектностью вирусов. Поскольку в популяции помимо стандартных присутствуют дефектные неинфекционные вирусные частицы, утратившие часть генетического материала, комплементация имеет место в инфекционном цикле многих вирусов. Члены популяции снабжают друг друга продуктами генов, которые дефектны у партнеров (негенетическая реактивация).

Интерференцией вирусов обозначают состояние невосприимчивости к вторичному заражению клетки, уже инфицированной вирусом. Различают интерференцию гетерологическую и гомологическую.

Гетерологическая интерференция. Инфицирование одним вирусом полностью блокирует возможность репликации второго вируса в пределах одной клетки. Один из механизмов гетерологической интерференции связан с угнетением адсорбции другого вируса путём блокирования или разрушения специфичных рецепторов. Другой механизм связан с ингибированием трансляции мРНК любой гетерологичной мРНК в инфицированной клетке. Гомологическая интерференция. Процесс типичен для многих дефектных вирусов, особенно для повторно пассируемых in vitro и с высокой множественностью инфицирования. Дефектные вирусы обычно не способны к самостоятельной репродукции. Их репродукция возможна лишь при заражении клетки совместно с нормальным вирусом. В подобных взаимодействиях последний называют вирусом-помощником.Иногда дефектный вирус может вмешиваться в репродуктивный цикл нормального вируса и образовывать дочерние дефектные интерферирующие (ДИ) вирусные частицы.

ПРионы

Прио́ны (англ. prion от protein — «белок» и infection — «инфекция») — особый класс инфекционныхагентов, представленных белками с аномальной третичной структурой и не содержащих нуклеиновых кислот. Прионы способны увеличивать свою численность, используя функции живых клеток (в этом отношении прионы схожи с вирусами). Прион — это белок с аномальной трёхмерной (третичной) структурой, способный катализировать конформационное превращение гомологичного ему нормального клеточного белка в себе подобный (прион). Как правило, при переходе белка в прионное состояние его α-спирали превращаются в β-слои. Появившиеся в результате такого перехода прионы могут в свою очередь перестраивать новые молекулы белка; таким образом, запускается цепная реакция, в ходе которой образуется огромное количество неправильно свёрнутых молекул. Прионы — единственные известные инфекционные агенты, размножение которых происходит без участия нуклеиновых кислот. Вопрос о том, считать ли прионы формой жизни, в настоящий момент является открытымПрионы вызывают заболевания — трансмиссивные губчатые энцефалопатии (ТГЭ) у различных млекопитающих, в том числе губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота («коровье бешенство»). Учеловека прионы вызывают болезнь Крейтцфельдта — Якоба, вариант болезни Крейтцфельдта — Якоба (vCJD), синдром Герстмана — Штраусслера — Шейнкера, фатальную семейную бессонницу икуру[7]. Все известные прионные заболевания поражают головной мозг и другие нервные ткани, в настоящее время неизлечимы и в конечном итоге смертельны.

Билет 40

1) 41.Методика культивирование вирусов в культуре клеток.

Культура клеток - это выращенные in vitro (вне организма) на специальных средах клетки различных тканей животных и человека, в том числе лейкоциты, сохраняющие присущие им обмен и восприимчивость к определенным вирусам. Главное требование при работе с культурами клеток и вирусами - строгое соблюдение стерильности, которое достигается в асептических условиях вирусологического бокса. Для выращивания клеток (тканей) применяют различные питательные среды (199 или Игла), содержащие полный набор необходимых им веществ (аминокислоты, пурины, пиримидины, углеводы, витамины и др.) с добавлением бычьей сыворотки. Имеется много типов культур клеток: 1) первичные культуры, способные к 5-10-кратному пассированию; 2) неограниченно перевиваемые; 3) полуперевиваемые, представляющие собой морфологически однородные клетки легких и почек человека, сохраняющие в 50 пассажах диплоидный набор хромосом. Все эти типы клеток выращивают при температуре 36-37 °С в ультратермостатах, получая в течение 5-7 суток хороший монослой в виде пласта, сцепленного со стенками матрацев, флаконов и пробирок. Контролируют рост клеток под малым увеличением микроскопа, начиная с 3-4 дня. Первичные культуры клеток. Источником получения первичных культур клеток являются обладающие большой потенцией роста эмбриональные ткани птиц (главным образом куриные фибробласты), экспериментальных животных, обезьян, но чаще всего готовят их из трипсинизированных тканей абортированных 8-14-недельных плодов человека. Для этого ткань плода измельчают ножницами на мелкие кусочки размером 2-4 мм и 2-3 раза отмывают от крови буферным раствором Хенкса, пока жидкость не станет почти прозрачной. Затем для разрушения межклеточного вещества кусочки ткани заливают подогретым до 32-37 °С 0,25%-м раствором трипсина, и в смесителе на электромагнитной мешалке перемешивают взвесь в течение 10-30 мин. Первую порцию трипсинизированных клеток удаляют. Подходящие для культивирования вирусов клетки получают после повторных трипсинизации. Далее содержащую клетки жидкость для отделения крупных комочков ткани и соединительнотканных волокон фильтруют через марлю, центрифугируют при 800-1000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость сливают, осадок отмывают раствором Хенкса и разводят средой 199 (или Игла), чтобы получить в 1 мл 100 000-400 000 клеток. Взвесь клеток разливают по 1 мл в пробирки или по 20-100 мл в стеклянные матрацы, плотно закрывают резиновыми пробками и помещают в термостат при температуре 37 °С. Матрацы располагают в горизонтальном положении, а пробирки -под углом 5-10° в специальных лотках. Прикрепляясь к стеклу, клетки в течение нескольких суток образуют монослой. Перевиваемые культуры клеток. Это стабильные или, как их нередко называют, иммортализованные (бессмертные) линии клеток, автономно размножающиеся, подобно бактериям. Получают их из нормальных тканей человека (амниона - почек -, диплоидных клеток); животных (почек обезьян -; почек кролика - и его роговицы -) и злокачественных опухолей (шейки матки-, гортани -, полости рта -, костного мозга человека - и др.), которые выращиваются путем последовательных пассажей на питательных средах вот уже многие десятки лет.

2) 48. Селекция вирусов. Методы селекции.