Характеристика вируса бешенства и вызываемого им заболевания.

Бешенство – острая инфекционная болезнь, протекающая с тяжелым поражением НС, как правило, с летальным исходом. Восприимчивы человек и все млекопитающие животные. Бешенство распространено повсеместно. Возбудителя передают собаки, кошки, дикие грызуны и хищники, а также кровососущие летучие мыши-вампиры. Продолжительность инкубационного периода зависит от места, силы укуса, количества и вирулентности попавшего в рану вируса, резистентности покусанного животного. Инкубационный период длится от 1-3 недель до года и более. Болезнь протекает остро. Клинические признаки при атипичном течение – потеря аппетита, атония рубца, паралич глотки, слюнотечение. Также может быть буйное и тихое течение болезни. Вирус бешенства (ВБ) обладает выраженной нейропробазией. Проникая с периферии по нервным стволам в центральную НС центростремительно, он распространяется в организме центробежно по периферическим нервам и попадает в разные органы, включая слюнные железы.Вирус относится к семейству Rhabdoviridae, родуLyssavirus. Вирионы имеют форму стержня с обрубленным концом. Вирион вируса – РНК-содержащий со спиральным типом симметрии, имеет липопротеидную оболочку. Низкие температуры консервируют вирус. Вирион ВБ содержит гликопротеидный и нуклеокапсидный АГ. Первый индуцирует образование вируснейтрализующих АТ, а второй – комплементсвязывающих и преципитирующих АТ. В организме вирус локализуется главным образом в ЦНС, в слюнных железах, слюне. Культивируется на мышах, кроликах, морских свинках, в первичных культурах клеток. Размножение вируса в КК не всегда проявляется ЦПД. Источников инфекции являются больные животные. Они передают вирус во время укуса. Диагноз на бешенство ставят на основании эпизоотологических, клинических данных и результатов лабораторных исследований, имеющих решающее значение. Для исследования направляют в лабораторию свежие трупы мелких животных целиком, а от крупных и средних животных – голову с 2 шейными позвонками. Трупы мелких животных перед отправкой на исследование обрабатывают инсектицидами. Лабораторная диагностика включает: обнаружение вирусного АГ в РИФ и РДП, телец Бабеша-Негри и биопробы на белых мышатах. РИФ – для данной реакции биопромышленность выпускает флуоресцирующий антирабический гамма-глобулин. Принцип – 1)Делают отпечатки или мазки из различных отделов ГМ левой и правой стороны на предметных стеклах (не менее 2 препаратов из каждого отдела); 2)Их высушивают, фиксируют в охлажденном ацетоне; 3)Высушивают, наносят флуоресцирующий гамма-глобулин; 4)Помещают во влажную камеру; 5)Тщательно промываю ИХН, споласкивают водой, высушивают на воздухе, наносят нефлуоресцирующее иммерсионное масло и просматривают под люминесцентным микроскопом. В препаратах, содержащих АГ ВБ, наблюдаются разной величины и формы флуоресцирующие желто-зеленым цветом гранулы в нейронах, но чаще вне клеток. РДП – 1)Наливают на предметные стекла агаровый гель 2)Делают лунки (Д=4-5 мм); 3)Лунки заполняют пастообразной массой из отделов ГМ. 4)Контроли с «+» и «-«АГ ставят на отдельном стекле по тому же трафарету; 5)После заполнения лунок препараты помещают во влажную камеру и ставят в термостат при 37С на 6 часов, затем при комнатной температуре на 18 часов. Реакцию считают положительной при появлении одной или 2-3 линий преципитации любой интенсивности между лунками, содержащими суспензию мозга и антирабический гамма-глобулин. ВЫЯВЛЕНИЕ ТЕЛЕЦ – на предметных стеклах делают тонкие мазки или отпечатки из всех отделов ГМ и окрашивают по Селлерсу или Муромцеву или Манну или Ленцу. БИОПРОБА – отбирают белых мышей (16-20 грамм), нервную ткань из всех отделов ГМ растирают в ступке со стерильным песком, добавляют ИХН до 10-% суспензии, отстаивают 30-40 минут и для заражения используют надосадочную жидкость для заражения мышат. Заражают 10-12 шт: половину интрацеребрально по 0,03 мл, половину подкожно в область носика или в верхнюю губу по 0,1-0,2 мл. Наблюдают 30 дней. При наличии ВБ в патматериале с 7-10 дня после заражения у мышей наблюдают симптомы: взъерошенность шерсти, своеобразную горбатость спины, нарушение координации движений, паралич задних, затем передних конечностей и гибель. У павших мышей ГМ исследуют в РИФ на обнаружение телец Бабеша-Негри и ставят РДП. Биопробу на бешенство считают положительно, если в препаратах из мозга зараженных мышат обнаруживают тельца Бабеша-Негри или выявляют АГ методами РИФ или РДП. Отрицательный диагноз – отсутствие гибели мышат в течение 30 дней.

Билет 26

1) 34.Культивирование вирусов в организме животных. гнотобиоты, гнотофоры.Линейные, спф животные.

Для культивирования вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы и чувствительных лабораторных животных. Эти же методы используют и для культивирования риккетсий и хламидий — облигатных внутриклеточных бактерий, которые не растут на искусственных питательных средах.

Культуры клеток. Культуры клеток готовят из тканей животных или человека. Культуры подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые.

Приготовление первичной культуры клеток складывается из нескольких последовательных этапов: измельчения ткани, разъединения клеток путем трипсинизации, отмывания полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост, например в среде 199 с добавлением телячьей сыворотки крови.

Перевиваемые культуры в отличие от первичных адаптированы к условиям, обеспечивающим им постоянное существование in vitro, и сохраняются на протяжении нескольких десятков пассажей.

Перевиваемые однослойные культуры клеток приготовляют из злокачественных и нормальных линий клеток, обладающих способностью длительно размножаться in vitro в определенных условиях. К ним относятся злокачественные клетки HeLa, первоначально выделенные из карциномы шейки матки, Нер-3 (из лимфоидной карциномы), а также нормальные клетки амниона человека, почек обезьяны и др.

К полуперевиваемым культурам относятся диплоидные клетки человека. Они представляют собой клеточную систему, сохраняющую в процессе 50 пассажей (до года) диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток используемой ткани. Диплоидные клетки человека не претерпевают злокачественного перерождения и этим выгодно отличаются от опухолевых.

О размножении (репродукции) вирусов в культуре клеток судят по цитопатическому действию (ЦПД), которое может быть обнаружено микроскопически и характеризуется морфологическими изменениями клеток.

Характер ЦПД вирусов используют как для их обнаружения (индикации), так и для ориентировочной идентификации, т. е. определения их видовой принадлежности.

Один из методов индикации вирусов основан на способности поверхности клеток, в которых они репродуцируются, адсорбировать эритроциты — реакция гемадсорбции. Для ее постановки в культуру клеток, зараженных вирусами, добавляют взвесь эритроцитов и после некоторого времени контакта клетки промывают изотоническим раствором хлорида натрия. На поверхности пораженных вирусами клеток остаются прилипшие эритроциты.

Другой метод — реакция гемагглютинации (РГ). Применяется для обнаружения вирусов в культуральной жидкости культуры клеток либо хорионаллантоисной или амниотической жидкости куриного эмбриона.

Количество вирусных частиц определяют методом титрования по ЦПД в культуре клеток. Для этого клетки культуры заражают десятикратным разведением вируса. После 6—7-дневной инкубации их просматривают на наличие ЦПД. За титр вируса принимают наибольшее разведение, которое вызывает ЦПД в 50 % зараженных культур. Титр вируса выражают количеством цитопатических доз.

Более точным количественным методом учета отдельных вирусных частиц является метод бляшек.

Некоторые вирусы можно обнаружить и идентифицировать по включениям, которые они образуют в ядре или цитоплазме зараженных клеток.

Куриные эмбрионы. Куриные эмбрионы по сравнению с культурами клеток значительно реже бывают контаминированы вирусами и микоплазмами, а также обладают сравнительно высокой жизнеспособностью и устойчивостью к различным воздействиям.

Для получения чистых культур риккетсий, хламидий и ряда вирусов в диагностических целях, а также для приготовления разнообразных препаратов (вакцины, диагностикумы) используют 8—12-дневные куриные эмбрионы. О размножении упомянутых микроорганизмов судят по морфологическим изменениям, выявляемым после вскрытия эмбриона на его оболочках.

О репродукции некоторых вирусов, например гриппа, оспы, можно судить по реакции гемагглютинации (РГА) с куриными или другими эритроцитами.

К недостаткам данного метода относятся невозможность обнаружения исследуемого микроорганизма без предварительного вскрытия эмбриона, а также наличие в нем большого количества белков и других соединений, затрудняющих последующую очистку риккетсий или вирусов при изготовлении различных препаратов.

Лабораторные животные. Видовая чувствительность животных к определенному вирусу и их возраст определяют репродуктивную способность вирусов. Во многих случаях только новорожденные животные чувствительны к тому или иному вирусу.

2) 59. Классы лимфоцитов, дифференциация их в Т- и В-клетки.Классы лимфоцитов. В 60-е годы были установлены два основных класса лимфоцитов: Т-клетки, развивающиеся в тимусе, ответственны за леточный иммунитет и В-клетки, которые развиваются независимо от тимуса, ответственны за антителопродукцию.Однако некоторые из Т-клеток играют важную роль в регуляции иммунитета и функционируют как помощники В-клеток в процессе гуморального ответа.Т-лимфоциты возникают из клеток-предшественников, расселяющихся из костного мозга в тимус.

После завершения дифференциации Т-лимфоциты мигрируют в лимфатические узлы и селезенку,где под воздействием антигена размножаются. Они постоянно циркулируют с кровью и лимфой, проникая практически во все ткани организма. Т-лимфоциты, реагируя на антиген, начинают превращаться в бластные клетки и клонально размножаются. При этом у них возникают четко выраженные иммунологические функции. Они являются эффективными клетками, выполняющими функции клеточного иммунитета.По функциональным свойствам Т-клетки делятся на четыре категории:

1. Т-клетки-хелперы выполняют определенную иммунологическую функцию в становлении гумморального иммунитета за счет кооперации с В-лимфоцитами. Подобное взаимодействие клеток способствует размножению клона В-лимфоцитов и интенсивной продукции антител.

2. Т-лимфоциты, играющие иммунорегуляторную роль, так как они могут усиливать или супрессировать иммунный ответ с помощью специфических субпопуляций Т-клеток (Т-клетки-супрессоры), переключая синтез иммуноглобулинов.

3. Т-клетки-киллеры обладают способностью убивать клетки-мишени, чужеродные для организма, против которых они были ранее сенсибилизированы. На клетках-мишенях имеются антигены, распознаваемые Т-клетками.

4. Т-клетки, продуцирующие медиаторы клеточного иммунитета, которые образуются при воздействии антигенов. Повышают поглотительную активность макрофагов, выделяя вещества, способствующие иммобилизации макрофагов.У эмбрионов человека и других млекопитающих B-лимфоциты образуются в печени и костном мозге из стволовых клеток, а у взрослых млекопитающих — только в костном мозге. Дифференцировка В-лимфоцитов проходит в несколько этапов, каждый из которых характеризуется присутствием определённых белковых маркеров и степенью генетической перестройки генов иммуноглобулинов.B-лимфоциты происходят от плюрипотентных гемопоэтических стволовых клеток, дающих также начало всем клеткам крови. Стволовые клетки находятся в определённом микроокружении, которое обеспечивает их выживание, самообновление или, при необходимости, дифференцировку. Микроокружение определяет,по какому пути пойдёт развитие стволовой клетки (эритроидному, миелоидному или лимфоидному)[1].Дифференцировка В-лимфоцитов условно делится на две стадии — антигеннезависимую (в которую происходит перестройка генов иммуноглобулинов и их экспрессия) и антигензависимую (при которой происходит активация, пролиферация и дифференцировка в плазматические клетки). Выделяют следующие промежуточные формы созревающих В-лимфоцитов:Ранние предшественники В-клеток — не синтезируют тяжёлых и лёгких цепей иммуноглобулинов, содержат

зародышевые IgH и IgL гены, но содержат антигенный маркер, общий со зрелыми пре-В-клетками.

Ранние про-В-клетки — D-J перестройки в IgН генах.

Поздние про-В-клетки — V-DJ перестройки в IgН генах.

Большие пре-В-клетки — IgН гены VDJ-перестроены; в цитоплазме имеются тяжёлые цепи класса

экспрессируется пре-В-клеточный рецептор.

Малые пре-В-клетки — V-J перестройки в IgL генах; в цитоплазме имеются тяжёлые цепи класса?.

Малые незрелые В-клетки — IgL гены VJ-перестроены; синтезируют тяжёлые и лёгкие цепи; на мембране экспрессируются иммуноглобулины (B-клеточный рецептор).Зрелые В-клетки — начало синтеза IgD.В-клетки поступают из костного мозга во вторичные лимфоидные органы (селезёнку и лимфатические узлы), где происходит их дальнейшее созревание, презентация антигена, пролиферация и дифференцировка в плазматические клетки и В-клетки памяти.