Принципы диагностики вирусных болезней животных

Билет 1

1) 10. Современная классификация вирусов, криптограммы вирусов.

Современная классификация вирусов универсальна для вирусов позвоночных, беспозвоночных, растений и простейших. Она базируется на фундаментальных свойствах вирионов, критерии которых положены в основу современной классификации:

1.тип нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК), ее структура;

2.наличие липопротеидной оболочки;

3.стратегия вирусного генома;

4.размер и морфология вириона, тип симметрии, число капсомеров;

5.антигенные свойства;

6.феномены генетических взаимодействий;

7.круг восприимчивых хозяев;

8.патогенность, в том числе патологические изменения в клетках и образование внутри-

клеточных включений;

9.географическое распространение;

10.способ передачи.

На основании перечисленных признаков вирусы подразделяются на порядки, семейства, подсемейства, роды и виды. Деление на семейства произведено по критериям, изложенным в пунктах 1 и 2, деление на роды и виды – на основании нижеперечисленных признаков.

Криптограмма вирусов - это кодированная запись их свойств.

Она состоит из четырех пар знаков или символов:

-первая пара - тип нуклеиновой кислоты((R – РНК, D – ДНК) и количество цепочек(1,2);

-вторая - молекулярная масса нуклеиновой кислоты (в млн. Дальтон, если она фрагментирована, то пишут знак?) и процент ее массы от молекулярной массы всего вириона;

-третья пара знаков описывает форму вириона (внешний облик) и форму нуклеокапсида(S – сферическая, U – удлиненная с параллельными сторонами и закругленным концом или концами, Е – удлиненная с параллельными сторонами и незакругленными концами, Х – сложная);

-четвертая пара описывает тип хозяина(А – актиномицеты, В – бактерии, F – грибы, I – беспозвоночные, S – семенные растения, V – позвоночные) и тип переносчика вируса(О – без переносчика, Ас – клещи, А1 – белокрылки, Аи – цикадки).

Характеристика семейства флавивирусов.

Flaviviridae — семейство вирусов, передающихся преимущественно членистоногими (клещами и комарами). Семейство получило такое название от вируса жёлтой лихорадки, (англ. Yellow Fever virus, от лат. flavus — жёлтый). Жёлтая лихорадка, в свою очередь, так называется потому, что вызывает желтуху[2].

Flaviviridae было выделено в отдельное семейство из семейства Togaviridaeв 1985 году. Семейство включает следующие роды:

·Flavivirus(характерные виды — вирус жёлтой лихорадки, вирус Западного Нила, вирус денге, вирус клещевого энцефалита) — включает 53 вируса человека и животных

·Hepacivirus— включает вирус гепатита C и несколько вирусов животных

·Pegivirus— включает 2 вида

·Pestivirus(характерный вид — вирус диареи скота, вирус классической лихорадки или чумы свиней) — включает 4 вируса, инфицирующих млекопитающих, но не человека.

Геном

Геном флавивирусов представлен несколькими линейными одноцепочечными (+)-РНК длиной от 9,6 до 12,3 тысяч нуклеотидов. На 5'-конце содержится метилированный нуклеотид (5'-кэп).

Вирион

Вирусные частицы покрыты оболочкой, имеют сферическую форму и диаметр около 40—60 нм.

Заболевания

Заболевания, вызываемые представителями семейства:

·Лихорадка денге

·Японский энцефалит

·Клещевой энцефалит

·Лихорадка Западного Нила

·Энцефалит Сент-Луис

·Жёлтая лихорадка

·Гепатит C

Билет 2

Принцип, схема постановки, достоинства и недостатки РИФ и ИФА.

Достоинства РИФ: высокая специфичность и чувствительность; простота техники постановки; требуется минимальное количество компонентов. Это экспресс-метод диагностики, так как в течение нескольких часов можно получить ответ. К недостаткам можно отнести субъективизм в оценке интенсивности свечения и, к сожалению, иногда флуоресцирующие сыворотки бывают плохого качества. В настоящее время РИФ широко применяют в диагностике вирусных болезней животных.

Достоинства ИФА: высокая чувствительность; специфичность; простота техники постановки; требуется минимальное количество компонентов; не требуется специальных приборов; оценку можно проводить визуально; возможность автоматизации, что позволяет его применять для массовых исследований; исследуемые сыворотки не требуют предварительной обработки. Это — экспресс-метод диагностики, так как в течение нескольких часов можно получить ответ.

Билет 3

Билет 4

1) 39.Первично-трипсинизированные,диплойдные и перевиваемые культуры клеток,их свойства и особенности.

Впервые культуры были использованы в 50-х гг. Клетки клсф-ся на:

1) ПЕРВИЧНО ТРИПСИНИЗИРОВАННЫЕ. Их получают из эмбриональной тк чка, обезьян и т.д. Тк помещают в спец пит среду, освобождают от разл ненужных эл-тов, измельчают, а затем заливают р-ром трипсина в сосуде. Помещают на магнитную мешалку, сосуд встряхивается. Затем проводят центрифугирование: живые  оседают, а мёртвые – всплывают. Надосадочную жидкость с мёртвыми  сливают, осадок заливают пит средой, взбалтывают и получают взвесь, а затем подсчитывают кол-во  в камере Горяева. Взвеси помещают в разл ёмкости и добавляют спец ростковую среду, прчём на 1 мл пит среды должо быть  2 млн . Они крепятся к поверхности стекла, омываются средой и начинают размножаться, покрывая пов сосуда МОНОСЛОЕМ. Затем ростковую среду сливают и добавляют поддерживающую ( не погибают, но и не размножаются) и ВИРУСЫ и культивируют 3-4 суток.

Если к поддерживающей среде добавить СЫВОРОТКУ КРОВИ, в к/й содержится спец белок ПЕТУИН, стимулирующий размножение (чаще всего исп сыв эмбрионов КРС), то получают ростковую среду.

Первично трипсинизированные культуры используются ТОЛЬКО 1 РАЗ.

ПЕРЕВИВАЕМЫЕ (БЕССМЕРТНЫЕ) – это раковые клетки: Hela, Hep-1, Hep-2 – были получены в 50-х гг, затем их постоянно пересеивали. В этом случае из старой пробирки выливают пит среду и добавляют ВЕРСЕН, под его влиянием  отлипают. Взвесь клеток с этим в-вом центрифугируют,  оседают, версен сливают и добавляют поддерживающий пит раствор. Т.о., снова получают готовую культуру.

Вирусы в клеточной культуре выявляют по их цитопатическому действию:

1) по образованию ими на среде сплошного (газонного) роста бесклеточных "бляшек"

2) по вакуолизации клеток культуры

3) появлению клеточных включений

Также используются электронная микроскопия и серологические реакции

Билет 5

1) 16. Подготовка вируссодержащего материала для исследования.

В лаборатории полученный патматериал освобождают от консерванта, оттаивают, отмывают от глицерина, взвешивают или измеряют. Часть материала берут для вирусологических исследований, оставшуюся часть хранят в холодильнике на случай дополнительных исследований. Затем составляют план исследований присланного материала.

Подготовка органов и тканей. \ Вирус необходимо высвободить из клеток органов и тканей и перевести в фосфатный буфер или раствор Хенкса. Для этого материал тщательно измельчают ножницами и растирают в ступке со стерильным кварцевым песком. Из растертого материала обычно готовят 10%-ную суспензию на фосфатном буфере или растворе Хенкса. Полученную суспензию центрифугируют при 1500-3000 мин, надосадочную жидкость отсасывают в стерильные флаконы и освобождают от микрофлоры. Следует избегать излишне больших доз антибиотиков, так как их избыток при дальнейшем внесении в культуру клеток может вызвать неспецифическую дегенерацию последних. Предпочтительность тех или иных доз антибиотиков и оптимальный режим центрифугирования в каждом конкретном случае указываются в инструкции по диагностике соответствующих вирусных болезней. Экспозиция суспензии с антибиотиками не менее 30-60 минут при комнатной температуре, затем материал подвергают бактериологическому контролю на наличие бактерий, грибов путем посева на МПА, МПБ, МППБ и среду Сабуро. После получения отрицательного результата бактериологического контроля вируссодержащий материал используют для заражения лабораторных животных, куриных эмбрионов или культур клеток. В случае положительного бактериологического контроля суспензию вируса подвергают дополнительной обработке антибиотиками и повторно ставят контроль. Суспензию хранят при минус 20°С - минус 70 °С.

Подготовка выделений из носа, глаз. \Тампоны, погруженные в соответствующий раствор, встряхивают 10-15 мин, тщательно отжимают, полученную жидкость центрифугируют 20 мин при 2-3 тыс. мин. Надосадочную жидкость отсасывают в стерильную пробирку и в нее добавляют пенициллин и стрептомицин по 500-1000 ЕД. на 1 мл, выдерживают и после бактериологического контроля используют для заражения. Из осадка клеток готовят мазки для РИФ.

Подготовка фекалий. \Пробу кала (приблизительно 1 г) помещают в баночку с бусами, содержащую 10 мл раствора Хенкса или фосфатно-буферного раствора. После гемогенизации материала встряхиванием и последующего центрифугирования при 2-3 тыс. мин в течение 30 мин надосадочную жидкость отсасывают, добавляют пенициллин, стрептомицин по 500-1000 ЕД./мл, нистатин 30 ЕД./мл и 200 мкг тетрациклина на 1 мл. После 30-60-минутного контакта производят посев па стерильность, замораживают и хранят при минус 10°С - минус 20°С. В день заражения исследуемый материал оттаивают и повторно центрифугируют для удаления вновь образующегося после замораживания осадка. Неиспользованный материал хранят в замороженном состоянии до конца исследования. Исследование кала может быть заменено ректальными мазками, обработка которых требует меньше времени, а частота выделения вируса при этом не только не меньше, но иногда выше, чем при исследовании кала. Мочу обрабатывают антибиотиками (500-1000 ЕД/мл) и используют для заражения. Содержимое папул, пузырьков и пустул, чешуйки и корки исследуют при кожных высыпаниях. Содержимое папул и пузырьков разводят физиологическим раствором 1:5, а корки, чешуйки после растирания суспендируют в солевом растворе 1:5-1:10 и центрифугируют при 2-3 тыс. мин в течение 10-15 мин. После обработки пенициллином и стрептомицином (по 200-500 ЕД./мл) материал используют для заражения.

Подготовка крови. \Для выделения вируса может быть использована либо цельная дефибринированная, либо «лакйовая» кровь, либо кровь с антикоагулянтом. В последнем случае берут 5 мл крови в пробирку с 5-6 каплями гепарина и замораживают. После оттаивания гемолизированную кровь центрифугируют при 2-3 тыс. мин в течение 15 мин, добавляют пенициллин и стрептомицин из расчета 100-200 ЕД./мл и после проверки на стерильность используют для заражения. Для этих целей пригодна и свернувшаяся кровь. Ее растирают в ступке и добавляют небольшое количество раствора Хенкса (1:1 или 1:2).

2) 64. Титр вируса. Единицы количества вируса (ООЕ, БОЕ, ГАЕ, ЛД50, ЭЛД50, ИД50, ЭИД50, ЦПД50).\\\Титр вируса — это количество вируса, содержащееся в единице объема материала. Поскольку количество вируса невозможно выразить в обычно применяемых (объем, масса и т. п.) единицах, прибегают к измерению в единицах действия или единицах активности. Вирусы обладают инфекционным и гемагглютинирующим действием. Отсюда и единицы количества вирусов инфекционные и гемагглютинирующие. ЛД50—это доза вируса, убивающая 50 % лабораторных животных (обычно белых мышей);\ИД50—доза вируса, вызывающая клинические симптомы или патологоанатомические изменения у 50 % зараженных лабораторных животных;\ЭЛД — доза вируса, убивающая 50 % куриных эмбрионов;\ЭИД50—доза вируса, вызывающая патологоанатомические изменения у 50 % зараженных куриных эмбрионов;\ЦПД50— доза вируса, вызывающая цитопатический эффект у 50 % зараженных культур клеток (обычно пробирок с культурами клеток). Количество ЭД50 (ЛД50, ИД ЭЛД50, ЭИД50 или ЦПД50) вируса, содержащееся в единице объема вируссодержащего материала, и будет выражением титра (Т) вируса в этом материале. Например, Т=103,48 ЦПД50/0,1 мл означает, что в каждой 0,1 мл вируссодержащего материала содержится 103'48 доз вируса (т. е. более 1000, но менее 10 000, а именно 103,48=3020), каждая из которых способна вызвать цитопатический эффект в 50 % пробирок с культурой клеток.\Известны способы определения количества вируса в исследуемом материале по локальным повреждениям в зараженных культурах клеток и на хорион-аллантоисной оболочке (ХАО) куриных эмбрионов, в которых количество вируса учитывают в бляшкообразующих единицах (БОЕ), оспообразующих единицах (ООЕ). Однако использование методов затруднено в связи с тем, что при высокой концентрации вируса в исследуемом материале избежать слияния бляшек невозможно и соответственно невозможно провести количественную оценку [4]. Метод выполняют с живым вирусом, он трудоемкий и длительный по исполнению (72-96 часов).

Билет 6

Грипп лошадей

Грипп лошадей, или инфлюэнца, – острая высококонтагиозная вирусная болезнь, проявляющаяся угнетением, гипертермией (повышением температуры тела), слезотечением, кашлем, гиперемией и отечностью слизистых оболочек глаз, носа и трахеи. Болеют лошади всех возрастов.Возбудитель заболевания – вирусы из семейства ортомиксовирусов рода Инфлюэнца. Установлено, что в природе происходит обмен вирусами между человеком и лошадью, причем вирус гриппа лошади способен преодолевать барьер и вызывать инфицирование человека. Однако проявление гриппа лошадей у человека варьирует от бессимптомного до клинически слабо выраженного. Отмечается также родство между вирусами гриппа лошадей и некоторыми типами вируса гриппа птиц.Основной источник возбудителя инфекции – больное или переболевшее животное. Вирус выделяется во внешнюю среду с носовым секретом зараженных особей во время кашля. Возможна и непрямая передача микроба с кормом, водой, обслуживающим персоналом. Быстрому распространению вируса в табуне способствует наличие неиммуннизирован-ных лошадей.Инкубационный период болезни составляет 5–7 сут. Грипп проявляется внезапно. Животные безучастно стоят в денниках, в большинстве случаев отказываются от корма, их волосяной покров взъерошен. Затем температура тела повышается до 40–41 °C и может сохраняться несколько дней, появляется прерывистый, часто повторяющийся кашель с мокротой (наблюдается в течение 2-10 сут), переходящий в сухой, резкий, частый и болезненный. У больных лошадей слизистая оболочка носа кирпично-красного цвета, прозрачные истечения из носовой полости и глаз.Переболевшие животные приобретают иммунитет к повторному заражению таким же типом вируса продолжительностью не менее года. Жеребята могут иметь пассивный иммунитет от вакцинированных матерей.Диагноз ставят на основании клинических, эпизоотологических данных и лабораторного исследования крови.Лечение заключается в проведении ингаляций со скипидаром, 2 %-ным раствором натрия бикарбоната, гидрокарбоната и др. При осложнении используют сульфаниламиды, антибиотики (например, бензилпенициллин по 900 000 ЕД в 5 мл 0,5 %-ного раствора новокаина 2 раза в день), химиопрепараты (амантадин и его производные) и симптоматические средства лечения. Рекомендуется проводить аутогемотерапию (введение собственной крови) подкожно по 60 мл крови, через 2–3 дня повторив с увеличением дозы на 20 мл.Профилактика гриппа лошадей заключается в создании оптимальных условий содержания и кормления животных, карантинировании вновь прибывших особей, введении инактивированных формолвакцин (иммунитет от них не превышает 4–6 мес). Больных лошадей изолируют, освобождают от работы и тренировок, обеспечивают легкоперевариваемыми кормами и теплой водой. Переболевших животных в работу вовлекают постепенно. Патогенез. Легкие лошадей имеют особенности строения, которые отчасти обусловливают характер поражений при вирусных респираторных заболеваниях. Вирусы гриппа обладают выраженным тропизмом к эпителию дыхательных путей, особенно клеткам цилиндрического эпителия нижней носовой раковины и трахеи. Проникнув в них, вирус начинает интенсивно репродуцироваться, вызывая дистрофию, некроз, слущивание эпителия. Поврежденная слизистая оболочка становится проницаемой для вирусов, вовлекается подлежащая ткань с сосудистой сетью. В результате разрушения клеток развивается реактивное воспаление, что, однако, не препятствует дальнейшему прогрессированию инфекции. Процесс распространяется на нижние отделы респираторного тракта: развиваются эрозивный бронхит, перибронхит, периартериит, бронхопневмония. Могут возникать поражения и других органов — миокардит, энцефалопатия. Хотя вирусы гриппа довольно быстро разрушаются в организме, их токсичные субстанции, продукты распада клеток, бактерии устремляются в кровеносное русло, в результате чего возможны полнокровие, стазы, кровоизлияния. Существенные нарушения свертывающей и фибринолитической систем усугубляют развитие геморрагического синдрома. Синергизм перечисленных процессов способствует усилению протеолитической и цитотоксической активности вируса, деструкции капиллярных стенок, генерализации инфекции, развитию сливных пневмоний с отеком легких. Выделяющийся из клеток вирус поражает новые участки эпителия, и в патологический процесс вовлекается обширная поверхность слизистой оболочки. При слабой резистентности макроорганизма развивается вторичная инфекция с участием различных бактерий. У жеребых кобыл вследствие интоксикации может наступить гибель плода. В ответ на размножение вируса гриппа возникают специфические иммунные реакции организма, продуцируются местные антитела к вирусу, которые играют ведущую роль в защите организма при гриппозной инфекции.

Билет 7

Билет 8

Билет 9

Билет 10

Билет 11

Билет 12

Билет 13

Билет 14

Билет 15

Билет 16

Билет 17

Билет 18

1) 40.Методика приготовления культуры клеток фибробластов эмбрионов кур.

Культуры клеток можно получать не только из органов эмбрио­нов, но и из органов различных молодых убитых животных, одна­ко адаптация эмбриональных клеток к искусственным питательным средам, интенсивность размножения и чувствительность их к различным вирусам значительно выше, чем у клеток, полученных из органов молодых и взрослых животных.

Часто в ветеринарной практике для приготовления КК используют 9-10 суточные куриные эмбрионы (КЭ), эмбрионы кроликов, мышей, морских свинок, различных сельскохозяйственных и домашних жи­вотных. В медицинской вирусологии чаше всего применяют различ­ные перевиваемые линии клеток и культуры клеток из фибробластов эмбриона человека. Этот материал очень дешевый, стерильный и всегда в достаточном количестве имеется в гинекологических отделениях родильных домов, после прерывания беременности у женщин.

Открытию метода культивирования животных клеток in vitro предшествовали многолетние поиски и разработки рецепта питательной среды для изготовления дешевой лабораторной модели для культивирования вирусов, которые могли бы заменить КЭ, лабораторных и сельскохозяйственных животных. Приоритет в этом вопросе принадлежит американским ученым. В 1943 году Херанг, в 1949 году Эндрес изучали этапы дегенерации клеток под действием вируса, впоследствии названных цитопатическим действием (ЦПД). Живые и погибшие клетки хорошо видны в обычный световой микроскоп уже при малом увеличении. В 1952 году аме­риканские исследователи Дульбеко и Фогт разработали методику получения первично трипсинизированных культур клеток, которые сразу же получили широкое внедрение в практику медицинских и ветеринарных вирусологических лабораторий, биокомбинатов, би­офабрик и других учреждений.

В последние 25-30 лет разработаны методики получения диплоидных, перевиваемых, суспензионных и других культур, которые, более экономичны в вирусологической практике.

Культуры клеток применяются для:

1. Обнаружения вируса в исследуемом патологическом материале на ЦПД.

2. Идентификации вируса, обнаружение специфических антител в исследуемых сыворотках крови и определение их титров по реакции нейтрализации на КК.

3. Накопления вируса для производства культуральных живых и убитых вирус вакцин.

4. Получения вирусных антигенов-диагностикумов для серологической диагностики вирусов

Билет 19

Билет 20

Билет 21

Билет 22

Билет 23

1) 31. Дефектные интерферирующие частицы, механизм образования, свойства, значение.

Способность к интерференции заключается в том, что дефектные интерферирующие частицы препятствуют размножению инфекционного гомологичного вируса, который для них служит вирусом-помощником. ДИ-частицы используют для своей репродукции продукты генов инфекционного вируса и тем самым специфически подавляют его репродукцию. Способность ДИ-частиц к самообогащению особенно отчетливо проявляется при серийном пассировании вируса с высокой множественностью заражения. Использование неразведенного вирусного инокулята при серийных пассажах in vivo или in vitro является лучшим методом для накопления ДИ-частиц, а применение разведенных инокулятов позволяет снизить их концентрацию до минимального уровня и повысить выход инфекционного вирусаюДефектные интерферирующие частицы обнаружены практически у всех вирусов животных (кроме вирусов оспы). Следует отметить, что аутоинтерференция, обусловленная ДИ-частицами, у пикорнавирусов выражена слабо. Интерферирующая способность ДИ-частиц может зависеть от типа клеточных культур. ДИ-частицы играют определенную роль в инфекции и иммунитете. Они могут ослабить естественную вирусную инфекцию в результате интерференции с гомологичным инфекционным вирусом и влияют на установление и поддержание персистентной инфекции in vivo и in vitro. Высокое содержание ДИ-частиц в живых вакцинах может влиять на их эффективность.

Билет 24

1) 32. Реакция клетки на вирусную инфекцию.

Заражение клетки вирусами начинается с адсорбции вируса на клеточной мембране, происходящей благодаря взаимодействию поверхностных белков вируса с мембранными рецепторами клетки. Различные вирусы используют для связи с мембраной клетки разные клеточные рецепторыТемпература, как правило, мало влияет на адсорбцию вирусов (при 4°С и при 37°С скорость этого процесса практически одинакова). Связывание вирусов с мембранными рецепторами не защищает вирусы от нейтрализации антителами.

Адсорбированные вирусы проникают в клетку с помощью эндоцитоза или путем слияния с клеточной мембраной. Оказавшись в цитоплазме, вирусы освобождаются от большинства белков (раздевание вирусов) и начинают реплицироваться. Проникновение в клетку, раздевание и репродукция вирусов зависят от интенсивности энергетического метаболизма клетки и биохимических изменений, происходящих в клеточной мембране и цитоскелете. Так, при температуре ниже 37°С проникновение вирусов в клетку замедляется.

Пусковым фактором проникновения вируса в клетку обычно служит связывание некоторых поверхностных белков вируса с мембранными рецепторами клетки. Эти белки представлены на поверхности вирусов по крайней мере несколькими молекулами, а количество мембранных рецепторов обычно достигает нескольких сотен.

В месте контакта вируса с клеточной мембраной происходит агрегация рецепторов, которая запускает механизм внутриклеточной передачи сигнала и стимулирует изменения в клеточной мембране. Адсорбция вируса обычно воспринимается клеткой как присоединение «нормального» лиганда к соответствующему рецептору.

Адсорбция многих вирусов запускает эндоцитоз, начинающийся с образования на мембране окаймленных ямок, покрытых клатрином. Затем формируются эндосомы, в составе которых вирусы поступают в цитоплазму. Данный способ проникновения в клетку характерен для пикорнавирусов, вирусов гриппа и аденовирусов. Последующее слияние вирусов с мембраной эндосом стимулируется понижением рН в эндосоме.

Влияние рН на процесс проникновения хорошо изучено у вируса гриппа. В адсорбции этих вирусов, агрегации рецепторов и эндоцитозе важную роль играют гемагглютинины внешней оболочки. Конформационные изменения гемагглютинина, возникающие при низком рН в эндосоме, приводят к выходу на поверхность молекулы амфифильных доменов, что приводит к слиянию внешней оболочки вируса и эндосомальной мембраны.

На молекулярном уровне процессы слияния с мембраной и раздевания большинства вирусов изучены плохо. В результате слияния липиды и белки внешней оболочки вируса смешиваются с липидами и белками клеточной мембраны, а нуклеокапсид вируса оказывается в цитоплазме.

У сложных вирусов в адсорбции и слиянии с клеточной мембраной могут последовательно участвовать разные белки внешней вирусной оболочки. Есть данные, что в разных тканях или на разных поверхностях эпителиальных клеток механизмы адсорбции вирусов и их проникновения в клетку неодинаковы.

Билет 25

Билет 26

1) 34.Культивирование вирусов в организме животных. гнотобиоты, гнотофоры.Линейные, спф животные.

Для культивирования вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы и чувствительных лабораторных животных. Эти же методы используют и для культивирования риккетсий и хламидий — облигатных внутриклеточных бактерий, которые не растут на искусственных питательных средах.

Культуры клеток. Культуры клеток готовят из тканей животных или человека. Культуры подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые.

Приготовление первичной культуры клеток складывается из нескольких последовательных этапов: измельчения ткани, разъединения клеток путем трипсинизации, отмывания полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост, например в среде 199 с добавлением телячьей сыворотки крови.

Перевиваемые культуры в отличие от первичных адаптированы к условиям, обеспечивающим им постоянное существование in vitro, и сохраняются на протяжении нескольких десятков пассажей.

Перевиваемые однослойные культуры клеток приготовляют из злокачественных и нормальных линий клеток, обладающих способностью длительно размножаться in vitro в определенных условиях. К ним относятся злокачественные клетки HeLa, первоначально выделенные из карциномы шейки матки, Нер-3 (из лимфоидной карциномы), а также нормальные клетки амниона человека, почек обезьяны и др.

К полуперевиваемым культурам относятся диплоидные клетки человека. Они представляют собой клеточную систему, сохраняющую в процессе 50 пассажей (до года) диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток используемой ткани. Диплоидные клетки человека не претерпевают злокачественного перерождения и этим выгодно отличаются от опухолевых.

О размножении (репродукции) вирусов в культуре клеток судят по цитопатическому действию (ЦПД), которое может быть обнаружено микроскопически и характеризуется морфологическими изменениями клеток.

Характер ЦПД вирусов используют как для их обнаружения (индикации), так и для ориентировочной идентификации, т. е. определения их видовой принадлежности.

Один из методов индикации вирусов основан на способности поверхности клеток, в которых они репродуцируются, адсорбировать эритроциты — реакция гемадсорбции. Для ее постановки в культуру клеток, зараженных вирусами, добавляют взвесь эритроцитов и после некоторого времени контакта клетки промывают изотоническим раствором хлорида натрия. На поверхности пораженных вирусами клеток остаются прилипшие эритроциты.

Другой метод — реакция гемагглютинации (РГ). Применяется для обнаружения вирусов в культуральной жидкости культуры клеток либо хорионаллантоисной или амниотической жидкости куриного эмбриона.

Количество вирусных частиц определяют методом титрования по ЦПД в культуре клеток. Для этого клетки культуры заражают десятикратным разведением вируса. После 6—7-дневной инкубации их просматривают на наличие ЦПД. За титр вируса принимают наибольшее разведение, которое вызывает ЦПД в 50 % зараженных культур. Титр вируса выражают количеством цитопатических доз.

Более точным количественным методом учета отдельных вирусных частиц является метод бляшек.

Некоторые вирусы можно обнаружить и идентифицировать по включениям, которые они образуют в ядре или цитоплазме зараженных клеток.

Куриные эмбрионы. Куриные эмбрионы по сравнению с культурами клеток значительно реже бывают контаминированы вирусами и микоплазмами, а также обладают сравнительно высокой жизнеспособностью и устойчивостью к различным воздействиям.

Для получения чистых культур риккетсий, хламидий и ряда вирусов в диагностических целях, а также для приготовления разнообразных препаратов (вакцины, диагностикумы) используют 8—12-дневные куриные эмбрионы. О размножении упомянутых микроорганизмов судят по морфологическим изменениям, выявляемым после вскрытия эмбриона на его оболочках.

О репродукции некоторых вирусов, например гриппа, оспы, можно судить по реакции гемагглютинации (РГА) с куриными или другими эритроцитами.

К недостаткам данного метода относятся невозможность обнаружения исследуемого микроорганизма без предварительного вскрытия эмбриона, а также наличие в нем большого количества белков и других соединений, затрудняющих последующую очистку риккетсий или вирусов при изготовлении различных препаратов.

Лабораторные животные. Видовая чувствительность животных к определенному вирусу и их возраст определяют репродуктивную способность вирусов. Во многих случаях только новорожденные животные чувствительны к тому или иному вирусу.

2) 59. Классы лимфоцитов, дифференциация их в Т- и В-клетки.Классы лимфоцитов. В 60-е годы были установлены два основных класса лимфоцитов: Т-клетки, развивающиеся в тимусе, ответственны за леточный иммунитет и В-клетки, которые развиваются независимо от тимуса, ответственны за антителопродукцию.Однако некоторые из Т-клеток играют важную роль в регуляции иммунитета и функционируют как помощники В-клеток в процессе гуморального ответа.Т-лимфоциты возникают из клеток-предшественников, расселяющихся из костного мозга в тимус.

После завершения дифференциации Т-лимфоциты мигрируют в лимфатические узлы и селезенку,где под воздействием антигена размножаются. Они постоянно циркулируют с кровью и лимфой, проникая практически во все ткани организма. Т-лимфоциты, реагируя на антиген, начинают превращаться в бластные клетки и клонально размножаются. При этом у них возникают четко выраженные иммунологические функции. Они являются эффективными клетками, выполняющими функции клеточного иммунитета.По функциональным свойствам Т-клетки делятся на четыре категории:

1. Т-клетки-хелперы выполняют определенную иммунологическую функцию в становлении гумморального иммунитета за счет кооперации с В-лимфоцитами. Подобное взаимодействие клеток способствует размножению клона В-лимфоцитов и интенсивной продукции антител.

2. Т-лимфоциты, играющие иммунорегуляторную роль, так как они могут усиливать или супрессировать иммунный ответ с помощью специфических субпопуляций Т-клеток (Т-клетки-супрессоры), переключая синтез иммуноглобулинов.

3. Т-клетки-киллеры обладают способностью убивать клетки-мишени, чужеродные для организма, против которых они были ранее сенсибилизированы. На клетках-мишенях имеются антигены, распознаваемые Т-клетками.

4. Т-клетки, продуцирующие медиаторы клеточного иммунитета, которые образуются при воздействии антигенов. Повышают поглотительную активность макрофагов, выделяя вещества, способствующие иммобилизации макрофагов.У эмбрионов человека и других млекопитающих B-лимфоциты образуются в печени и костном мозге из стволовых клеток, а у взрослых млекопитающих — только в костном мозге. Дифференцировка В-лимфоцитов проходит в несколько этапов, каждый из которых характеризуется присутствием определённых белковых маркеров и степенью генетической перестройки генов иммуноглобулинов.B-лимфоциты происходят от плюрипотентных гемопоэтических стволовых клеток, дающих также начало всем клеткам крови. Стволовые клетки находятся в определённом микроокружении, которое обеспечивает их выживание, самообновление или, при необходимости, дифференцировку. Микроокружение определяет,по какому пути пойдёт развитие стволовой клетки (эритроидному, миелоидному или лимфоидному)[1].Дифференцировка В-лимфоцитов условно делится на две стадии — антигеннезависимую (в которую происходит перестройка генов иммуноглобулинов и их экспрессия) и антигензависимую (при которой происходит активация, пролиферация и дифференцировка в плазматические клетки). Выделяют следующие промежуточные формы созревающих В-лимфоцитов:Ранние предшественники В-клеток — не синтезируют тяжёлых и лёгких цепей иммуноглобулинов, содержат

зародышевые IgH и IgL гены, но содержат антигенный маркер, общий со зрелыми пре-В-клетками.

Ранние про-В-клетки — D-J перестройки в IgН генах.

Поздние про-В-клетки — V-DJ перестройки в IgН генах.

Большие пре-В-клетки — IgН гены VDJ-перестроены; в цитоплазме имеются тяжёлые цепи класса

экспрессируется пре-В-клеточный рецептор.

Малые пре-В-клетки — V-J перестройки в IgL генах; в цитоплазме имеются тяжёлые цепи класса?.

Малые незрелые В-клетки — IgL гены VJ-перестроены; синтезируют тяжёлые и лёгкие цепи; на мембране экспрессируются иммуноглобулины (B-клеточный рецептор).Зрелые В-клетки — начало синтеза IgD.В-клетки поступают из костного мозга во вторичные лимфоидные органы (селезёнку и лимфатические узлы), где происходит их дальнейшее созревание, презентация антигена, пролиферация и дифференцировка в плазматические клетки и В-клетки памяти.

Билет 27

1) 36. Культура ткани в вирусологии,классификация,принципы получения культур ткани.

Тканевая культура, метод выращивания вне организма в искусственно созданных условиях клеток, тканей или органов. в культурах тканей и органов (органы эмбрионов) поддерживают их жизнеспособность или рост при сохранении дифференциации ткани, структуры и функции органа. Изолированный кусочек ткани или органа, используемый для культивирования вне организма, наз. эксплантатом. Культура клеток растёт вне организма без образования тканей.

В биол. исследованиях чаще применяют однослойные К. т. — популяции клеток, растущих на поверхности твёрдого субстрата (стекло, металл, пластмасса) в виде непрерывного слоя, и суспензионные., в к-рых клетки сохраняют жизнеспособность или размножаются взвешенными в питат. среде. В зависимости от степени приспособления к условиям культивирования различают пять типов культур клеток: первичная культура клеток, получаемая из тканей или органов, взятых непосредственно из организма (культура считается первичной до тех пор, пока её не пересеяли), линия клеток — первичная культура со времени получения субкультуры (пересева); стабильная линия клеток — клетки, способные размножаться (пересеваться) in vitro до бесконечности; линия диплоидных клеток — линия клеток, в к-рой не менее 75% клеток сохранили нормальный исходный кариотип; штамм клеток — популяция однородных по одному или нескольким признакам диплоидных клеток, сохраняющая специфич. свойства в течение определённого периода (до 50 пассажей). В дальнейшем штамм клеток или погибает, или превращается в стабильную линию клеток; при этом нормальный кариотип сменяется гетероплоидным набором хромосом. В первичных К. т. Сохраняется. Клетки большинства животных хорошо растут при рН 7,0—7,3. Оптимальная концентрация О2 в К. т. близка к содержанию его в воздухе. В питательной среде должны