Характеристика ротавирусов КРС и вызываемого ими заболевания

Ротавирусная инфекция крупного рогатого скота (Rotavirosis infectiosa bovium) — остропротекающее контагиозное заболевание новорожденных телят, характеризующееся поражением желудочно-кишечного тракта (профузным поносом, дегидратацией организма, развитием катарального или катарально-геморрагического гастроэнтерита). Возбудитель ротавирусной инфекции – Rotavirus bovines, calf diarrheae (scours) virus имеет двойной капсид. Внутренний капсид — икосаэдрической симметрии, сотообразной структуры. Наружный слой толщиной 3,5-4,0 нм состоит из полых структур, закрепленных на радиально расположенных отростках капсомеров внутреннего слоя. Морфологически различают 3 типа вирионов: полные-с двойной оболочкой, диаметром 65-75 нм; только с внутренним капсидом, диаметром 50-55 нм; гексагональные нуклеоиды – с сердцевиной, диаметром 30-40нм.

Нуклеоид во всех типах вирионов может встречаться пустым -электронно-микроскопически полым. Полные вирионы по форме напоминают колесо с тонким ободком (наружный капсид), толстыми, коротким спицами (отростки внутреннего капсидного слоя) и широкой ступицей (нуклеоид и внутренний капсидный слой). Колесовидная форма вирионов дала название и роду (rota- колесо, лат.).

Репродуцируется вирус в цитоплазме эпителия тонких кишок, и зрелые формы его освобождаются из клеток через разрывы цитоплазматической мембраны. Плавучая плотность вирионов 1,30-1, 38 г/см³ в градиенте плотности хлористого цезия. Инфекционность двухоболочечных вирионов выше, чем вирионов с одним внутренним капсидом. Бычий вирус сохраняет инфекционность при рН 3,0, нечувствителен к хлороформу и эфиру, быстро инактивируется при 50° С. Химотрипсин, папаин, пакреатин «снимают» наружный капсид. У вирионов бычьего вируса обнаружено 8 структурных полипептидов с молекулярной массой от 13500 до 41 000 Д. Пептид наружного слоя является гликопротеидом.Ротавирусы устойчивы к воздействию физических и химических факторов. Вирус устойчив к колебаниям рН от 3 до 10, действию концентрированных солей, жирорастворителей. Вирус сохраняется в фекалиях до 9 месяцев, в высушенном навозе до 7 лет. Для дезинфекции помещений применяют хлорсодержащие препараты, 5% раствор лизола, 7-8% раствор натрия гидроокиси, 2-5% раствор формальдегида. Заражение молодняка происходит алиментарно. В результате репродукции ротавирусов в ворсинках эпителиальных клеток тонкого кишечника происходит нарушение пристеночного пищеварения, разрушение и десквамация цилиндрического эпителия с последующей его заменой на незрелый кубический и плоский. Ворсинки укорачиваются, становятся функционально неполноценными, что приводит к резкому снижению синтеза ферментов: гамма-глобулина, дисахаридаз, расщепляющих мальтозу, сахарозу, лактозу. Все это обуславливает накопление их в организме, а также простых углеводов и токсинов, приводящих к интенсивной рефлекторной перистальтике, развитию диареи и обезвоживанию организма.

Билет 5

1) 16. Подготовка вируссодержащего материала для исследования.

В лаборатории полученный патматериал освобождают от консерванта, оттаивают, отмывают от глицерина, взвешивают или измеряют. Часть материала берут для вирусологических исследований, оставшуюся часть хранят в холодильнике на случай дополнительных исследований. Затем составляют план исследований присланного материала.

Подготовка органов и тканей. \ Вирус необходимо высвободить из клеток органов и тканей и перевести в фосфатный буфер или раствор Хенкса. Для этого материал тщательно измельчают ножницами и растирают в ступке со стерильным кварцевым песком. Из растертого материала обычно готовят 10%-ную суспензию на фосфатном буфере или растворе Хенкса. Полученную суспензию центрифугируют при 1500-3000 мин, надосадочную жидкость отсасывают в стерильные флаконы и освобождают от микрофлоры. Следует избегать излишне больших доз антибиотиков, так как их избыток при дальнейшем внесении в культуру клеток может вызвать неспецифическую дегенерацию последних. Предпочтительность тех или иных доз антибиотиков и оптимальный режим центрифугирования в каждом конкретном случае указываются в инструкции по диагностике соответствующих вирусных болезней. Экспозиция суспензии с антибиотиками не менее 30-60 минут при комнатной температуре, затем материал подвергают бактериологическому контролю на наличие бактерий, грибов путем посева на МПА, МПБ, МППБ и среду Сабуро. После получения отрицательного результата бактериологического контроля вируссодержащий материал используют для заражения лабораторных животных, куриных эмбрионов или культур клеток. В случае положительного бактериологического контроля суспензию вируса подвергают дополнительной обработке антибиотиками и повторно ставят контроль. Суспензию хранят при минус 20°С - минус 70 °С.

Подготовка выделений из носа, глаз. \Тампоны, погруженные в соответствующий раствор, встряхивают 10-15 мин, тщательно отжимают, полученную жидкость центрифугируют 20 мин при 2-3 тыс. мин. Надосадочную жидкость отсасывают в стерильную пробирку и в нее добавляют пенициллин и стрептомицин по 500-1000 ЕД. на 1 мл, выдерживают и после бактериологического контроля используют для заражения. Из осадка клеток готовят мазки для РИФ.

Подготовка фекалий. \Пробу кала (приблизительно 1 г) помещают в баночку с бусами, содержащую 10 мл раствора Хенкса или фосфатно-буферного раствора. После гемогенизации материала встряхиванием и последующего центрифугирования при 2-3 тыс. мин в течение 30 мин надосадочную жидкость отсасывают, добавляют пенициллин, стрептомицин по 500-1000 ЕД./мл, нистатин 30 ЕД./мл и 200 мкг тетрациклина на 1 мл. После 30-60-минутного контакта производят посев па стерильность, замораживают и хранят при минус 10°С - минус 20°С. В день заражения исследуемый материал оттаивают и повторно центрифугируют для удаления вновь образующегося после замораживания осадка. Неиспользованный материал хранят в замороженном состоянии до конца исследования. Исследование кала может быть заменено ректальными мазками, обработка которых требует меньше времени, а частота выделения вируса при этом не только не меньше, но иногда выше, чем при исследовании кала. Мочу обрабатывают антибиотиками (500-1000 ЕД/мл) и используют для заражения. Содержимое папул, пузырьков и пустул, чешуйки и корки исследуют при кожных высыпаниях. Содержимое папул и пузырьков разводят физиологическим раствором 1:5, а корки, чешуйки после растирания суспендируют в солевом растворе 1:5-1:10 и центрифугируют при 2-3 тыс. мин в течение 10-15 мин. После обработки пенициллином и стрептомицином (по 200-500 ЕД./мл) материал используют для заражения.

Подготовка крови. \Для выделения вируса может быть использована либо цельная дефибринированная, либо «лакйовая» кровь, либо кровь с антикоагулянтом. В последнем случае берут 5 мл крови в пробирку с 5-6 каплями гепарина и замораживают. После оттаивания гемолизированную кровь центрифугируют при 2-3 тыс. мин в течение 15 мин, добавляют пенициллин и стрептомицин из расчета 100-200 ЕД./мл и после проверки на стерильность используют для заражения. Для этих целей пригодна и свернувшаяся кровь. Ее растирают в ступке и добавляют небольшое количество раствора Хенкса (1:1 или 1:2).

2) 64. Титр вируса. Единицы количества вируса (ООЕ, БОЕ, ГАЕ, ЛД50, ЭЛД50, ИД50, ЭИД50, ЦПД50).\\\Титр вируса — это количество вируса, содержащееся в единице объема материала. Поскольку количество вируса невозможно выразить в обычно применяемых (объем, масса и т. п.) единицах, прибегают к измерению в единицах действия или единицах активности. Вирусы обладают инфекционным и гемагглютинирующим действием. Отсюда и единицы количества вирусов инфекционные и гемагглютинирующие. ЛД50—это доза вируса, убивающая 50 % лабораторных животных (обычно белых мышей);\ИД50—доза вируса, вызывающая клинические симптомы или патологоанатомические изменения у 50 % зараженных лабораторных животных;\ЭЛД — доза вируса, убивающая 50 % куриных эмбрионов;\ЭИД50—доза вируса, вызывающая патологоанатомические изменения у 50 % зараженных куриных эмбрионов;\ЦПД50— доза вируса, вызывающая цитопатический эффект у 50 % зараженных культур клеток (обычно пробирок с культурами клеток). Количество ЭД50 (ЛД50, ИД ЭЛД50, ЭИД50 или ЦПД50) вируса, содержащееся в единице объема вируссодержащего материала, и будет выражением титра (Т) вируса в этом материале. Например, Т=103,48 ЦПД50/0,1 мл означает, что в каждой 0,1 мл вируссодержащего материала содержится 103'48 доз вируса (т. е. более 1000, но менее 10 000, а именно 103,48=3020), каждая из которых способна вызвать цитопатический эффект в 50 % пробирок с культурой клеток.\Известны способы определения количества вируса в исследуемом материале по локальным повреждениям в зараженных культурах клеток и на хорион-аллантоисной оболочке (ХАО) куриных эмбрионов, в которых количество вируса учитывают в бляшкообразующих единицах (БОЕ), оспообразующих единицах (ООЕ). Однако использование методов затруднено в связи с тем, что при высокой концентрации вируса в исследуемом материале избежать слияния бляшек невозможно и соответственно невозможно провести количественную оценку [4]. Метод выполняют с живым вирусом, он трудоемкий и длительный по исполнению (72-96 часов).