Хемотаксономическая систематика

В основу построения хемотаксономической систематике легли результаты изучения физиолого-биохимических характеристик, как наиболее распространенный метод ус­тановления таксономической принад­лежности исследуемых микроорганиз­мов. «Хемотаксономические» методы некоторыми систематиками считаются одними из существенных для со­временной классификации бактерий и часто рас­сматриваются как отдельная часть в обзорах по так­сономии. Термин "хемотаксономия" обозначает использование аналитических методов при сборе информации, касающейся различных химических составляющих клетки, для классификации бак­терий. Систематика, основанная на изучении этих ха­рактеристик, в последние годы полу­чила новые перспективы в связи с разработкой и внедрением в практи­ку миниатюрных экспресс - тестов оп­ределения энзиматической активности. Ускоренные методы определения эн­зиматической активности широко ис­пользуются для идентификации энтеробактерий, вибрионов, стафилококков, анаэробных бактерий, грибов и других микроорга­низмов. При этом точность идентификации достигается у более чем 90 % штаммов.

В 50 - 70-е годы прошлого века для изучения тон­кой структуры бактерий и уточнения классификационных схем, а в послед­ние годы и для идентификации прокариотов и вирусов стали использо­вать разнообразные физико-химиче­ские, иммунохимические и молекулярно-генетические методы. Их ценность обусловлена возможностью расширить число изучаемых характеристик и бо­лее объективно подходить к их анали­зу. Выигрышным моментом приложе­ния вышеуказанных методических под­ходов в таксономических целях и для идентификации микроорганизмов яв­ляется также высокая скорость осу­ществления анализа, возможность оп­ределения нано- и субнанограмм ве­ществ, выявления различия по тем признакам, которые другими метода­ми анализировать невозможно. Все большую популярность приобретают для целей идентификации такие физи­ко-химические методы, как хроматография, электрофорез, термический анализ и их различные сочетания друг с другом и с другими физически­ми методами (ультрафиолетовая и инфракрасная спектроскопия, масс-спектрометрия, люминесцентный ана­лиз и др.)

С помощью разнообразных приемов хроматографии идентификацию мик­роорганизмов проводят, основываясь на определении продуктов метаболиз­ма микроорганизмов, состава жирных кислот, полисахаридов микробной клетки, на анализе разнообразных аминов, продуцируемых в культуральную жидкость, и других компонентов, как связанных с клеткой, так и выде­ляющихся в окружающую среду.

Анализ летучих и нелетучих конеч­ных продуктов метаболизма (спиртов, органических кислот) нашел широкое применение при идентифика­ции анаэробных, микроаэрофильных бактерий, псевдомонад, энтеробактерий, бацилл и других микроорганиз­мов. Определение конечных продуктов метаболизма позволяет идентифицировать микроорганизмы и без выделения их в чистой культуре. Идентификация и дифференциация микроорганизмов путем определения качественного и количественного со­става жирных кислот микробной клет­ки с помощью хроматографии основы­вается на том, что внутри штаммов или видов бактерий имеет место про­дукция схожих метаболических про­дуктов и одинаков профиль жирнокислотного состава. Анализ сложных липидов, экстра­гированных из бактерий позволяет с высокой точностью проводить родо­вую и видовую дифференциацию микроорганизмов. У бактерий обнаружено более 50 различных жирных кислот в коли­честве от следовых до 60 - 70 % сухо­го вещества. Для идентификации и дифференциации грамположительных и грамотрицательных бактерий все большее рас­пространение приобретает изучение микроб­ных липополисахаридов. Иссле­дование большого числа родов и ви­дов бактерий на способность продуци­ровать в культуральную жидкость разнообразные амины про­демонстрировало возможность приме­нения этого приема для хемосистематики и идентификации энтеробакте­рии и клостридий.

Исследование бактериальных бел­ков, пептидов и нуклеиновых кислот с помощью электрофореза в пластинках полиакриламидного геля для изучения таксономии и идентификации микро­организмов завоевывает все большую популярность. Современные методы электрофореза в полиакриламидном геле позволяют, например, провести разделение до 1000 бактериальных полипептидов в одном геле. При этом получают характерные для каждого белка пептидные карты. Так, ана­лиз состава растворимых белков раз­личных нейссерий позволил выявить для каждого организма бо­лее 200 индивидуальных полипептидов с характерным их расположением. Будучи высокочувствительным (дает возможность обнаруживать штаммовые различия), метод электрофореза растворимых белков весьма перспек­тивен при классификации микроорга­низмов.

Среди методических приемов, широ­ко используемых при изучении таксо­номии и идентификации микроорга­низмов, необходимо указать большую группу иммунохимических методов, направленных на изучение бактери­альных структур, обладающих анти­генными свойствами. В иммунохими­ческих реакциях при исследовании ми­кробных антигенов в качестве связы­вающего агента используются антите­ла в сочетании с разнообразными мет­ками или без них. В качестве меток применяют флюоресцентные вещест­ва, ферменты, радиоактивные изотопы, бактериофаги и другие субстраты. Наиболее широко для указанной вы­ше цели используются метод иммуно-флюоресценции, радиоиммунологический, иммуноферментный, иммуноэлектрофорез, радиальная иммунодиффузия, реакция коагглютинации, ла­текс-агглютинация и некото­рые другие. Изучение антиген­ных характеристик микроорганизмов с помощью этих методов позволяет дифференцировать их на уровне ро­дов и видов, а также является полез­ным маркером для инфраструктурно­го сравнения микроорганизмов. Новые перспективы для этих методов откры­лись с внедрением в последние годы в качестве диагностических реагентов моноклональных антител. Возник­ла возможность тонкого анализа ми­кробных макромолекул, обладающих иммуногенными свойствами; созда­лись предпосылки картирования анти­генных детерминант и исследования химической природы антигенов.

Своеобразным методом изучения поверхностных структур микроорга­низмов с целью их дифференциации и идентификации является тест агглю­тинации с лектинами (гликопротеиды и белки растительного, животного и микробного происхождения), способ­ными агглютинировать клетки и(или) преципитировать гликоконъюгаты.

Геносистематика

А.С. Антонов (1974), характеризуя новую отрасль систематики, основанную на достижениях молекулярной биологии, пишет: «Смысл термина «геносистематика», или «систематика генотипов»... таков: это наука о разнообразии генотипов организмов».

Важный шаг на пути создания систематики прокариот связан с успехами генетики и молекулярной биологии. Такие разнообразные приемы и методы, как определение размера генома микроорганизмов, нуклеотидный состав их ДНК, первичной структуры микробных биополимеров, гибридизация нуклеиновых кислот и некоторые другие в последние годы успешно используются в повседневной роботе микробиологических лабораторий для ускоренной идентификации микроорганизмов.

В 60-х гг. XX в. было установлено, что все свойства организма определяются уни­кальными химическими молекулами - ДНК, поэтому бактерии могут быть классифицированы путем сравнения их геномов. Сопоставляя состав ДНК, оказалось возможным на основании выявления степени сходства делать вывод о степени родства между организмами. Следовательно, определив количественное содержание оснований в молекулах ДНК разных организ­мов, можно получить представление о сходстве генетического аппарата этих организмов. Если ДНК содержит разные осно­вания, то организмы будут безусловно различны, так как одна и та же информация, по-видимому, не может быть записана разными буквами. Но два организма с одинаковым составом ДНК могут быть различны, так как одними и теми же буквами можно записать различную информацию.

Первоначально для таксономических целей сравнивали молярное содержание суммы гуанина и цитозина (ГЦ) в процентах от общего количества осно­ваний ДНК у разных объектов. Этот показатель у прокариот колеблется от 25 до 75 %. Различия в нуклеотидном составе ДНК свидетельствует о неоднородности сравниваемых микроорганизмов, хотя сходство не всегда является основанием отнесения микробов к одному виду.

Стоит отметить, что ГЦ-показатель дает возможность только для грубого сравнения геномов. Если организмы имеют одинаковый нуклеотидный состав ДНК, возможно и сходство и раз­личие между ними, поскольку генетическое кодирование основа­но не только на определенном содержании оснований в единице кодирования (триплете), но и на их взаимном расположении.

Более тонкий метод оценки генетического сходства организ­мов - сравнение нуклеотидных последовательностей ДНК из раз­ных источников методом ДНК-ДНК-гибридизации. Результаты этого метода мож­но считать в таксономическом отношении подобными иммунологическим методам с тем отличием, что здесь сравнению под­вергается не белок, а первичный источник информации ДНК.

Метод наи­более полезен для классификации на уровне вида, т.е. в случае высокой степени гомологии, и мало информативен для класси­фикации объектов на уровне высоких таксонов. В то же время часто несовпадение выводов, сделанных на основании фенотипических признаков и ДНК-гибридизации. В целом значение данных о строении ДНК для систематики прокариот огромно, так как позволяет перейти от установления степени сходства к выводам о степени родства между организмами.

Метод молекулярной гибридизации ДНК позволил провести переоценку таксономических позиций актиномицетов, псевдомонад, микобактерий, энтерококков и других микроорганизмов.

В отличие от нумерической систематики здесь определяется не часть фенотипически выраженных признаков, а вся сумма гене­тической информации. Если оставить в стороне технические трудности, обусловленные слипанием обрывков молекул ДНК, то эти данные представляют, несомненно, очень ценный для систе­матики признак, но, по-видимому, немногие сознают, что сла­бость его кроется именно в избытке информации. Поясним это на примере. Для осуществления автотрофного усвоения углекис­лоты организм должен обладать помимо обычных для гетеротрофов ферментов еще двумя специфическими энзимами: карбоксилазой рибулозодифосфата и фосфорибулокиназой. Информа­ция, характеризующая эти ферменты, будет записана 3_*10² пар оснований из общего числа порядка 10⁷ пар оснований. Вряд ли возможно извлечь систематическое отклонение порядка 10^-4, ха­рактеризующее автотрофный образ жизни, из-под генетического шума, обусловленного штаммовыми, видовыми и т. д. отличия­ми. Между тем этот признак характеризует разделение всего живого мира на растительную и животную ветви и в таксономи­ческом отношении имеет первостепенное значение.

Связь нумерической систематики с геносистематикой неслучайна, так как именно комплексное использование данных методов дает наиболее полную информацию о родственных взаимоотношений микроорганизмов.

Заметное место в таксономических исследованиях занимает тест гибридизации ДНК с рибосомальной РНК, где на гомологию исследуются небольшие фрагменты генетического материала.

Помимо анализа молекул ДНК для установления степени род­ства между прокариотными организмами разработаны методиче­ские подходы, позволяющие сравнивать продукты отдель­ных генов, выполняющие в клетке одинаковые функции.

Колебания нуклеотидного состава ДНК у эукариотных микроорганизмов (молярная доля, %): грибы — 26—70, водоросли — 37—68, простейшие — 22— 68; у высших растений и животных — 35—45.

Родство микроорганизмов можно также устанавливать на основании изучения локализации генов в группах сцепления в хромосомах этих организмов. Схожий характер сцепления - дополнительный аргумент в пользу близости сравниваемых бактерий. Дополнение этого метода рестрикционным анализом повышает возможность выявления сходства микроорганизмов.

Определенные данные, касающиеся родства исследуемых микроорганизмов, получают при проведении экспериментов по коньюгации, трансформации и трансдукции. При этом, чем выше частота выхода рекомбинантов, тем больше основание считать, что скрещиваемые бактерии генетически близки. Необходимо однако учитывать, что низкий выход гибридных форм при скрещивании может быть обусловлен не только различиями в их ДНК, но и рядом других причин.

Определенный вклад в определение таксономических признаков микроорганизма посредством генетического анализа генома вносят методы генетического клонирования и картирования.

Общее заключение по применению геносистематики состоит в том, что фенотипическое сходство организмов, особенно низших, далеко не всегда обусловлено сходством состава и гомологичностью ДНК. Если допустить, что эти данные отражают действительное родство генотипов, то приходится признать, что у низших организмов весьма сходные формы возникли из генетически различных прародителей. В этом случае, приходится допускать широкий обмен генетическим материалом, определяющим таксономически дифференцирующие фенотипические признаки. Иными словами, для микроорганизмов, например, бактерий, имеется общее пространство генотипических признаков, которые могут передаваться друг другу. В этом случае монофилетичность системы полностью устраняется, поскольку нельзя назвать одного предка.

Итак, ни нумерические методы, ни химические методы определения генетической близости организмов не могут быть положены в основу построения системы, хотя результаты этих методов имеют несомненную ценность.

СПЕЦКУРС «ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ. СИСТЕМАТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ»