Получение очищенных ферментных препаратов

Неочищенные ферментные препараты плесневых грибов успешно используют в спиртовой промышленности и пивоварении. В ряде производств: хлебопечении, пивоварении (для повышения стойкости пива) и других требуются очищенные ферментные препараты. Получение очищенных ферментных препаратов из сухой культуры плесневого гриба Аспергиллюс оризе по схеме, разработанной Калашниковым Е.Я., состоит из следующих операций:

1) экстрагирование ферментов,

2) очистка ферментной вытяжки,

3) осаждение ферментов и отделение выпавших осадков,

4) сушка, измельчение и упаковка ферментных препаратов.

Сухая культура гриба обычно содержит 60% нерастворимых веществ (остатки отрубей), 10% воды и 30% экстрактивных веществ. Для освобождения от балластных сухих веществ сухую культуру гриба экстрагируют водой, при этом ферменты и другие экстрактивные вещества переходят в раствор. Экстракцию производят по принципу противоточного выщелачивания в батарее из нескольких диффузоров при 20-25°С. Вода, проходя последовательно через все диффузоры, обогащается экстрактивными веществами, в частности ферментами, и получается ферментная вытяжка.

При установившемся режиме работы диффузионной батареи загружают один диффузор за другим сухой культурой гриба. После загрузки каждый из них заполняют вытяжкой из предыдущего диффузора и отбирают из головного диффузора ферментную вытяжку. Вода поступает в хвостовой диффузор, после чего выгружают выщелоченную культуру гриба, из которой извлечены почти все экстрактивные вещества, а воду подают на следующий диффузор. При батарее, состоящей из шести восьми диффузоров, вытяжка содержит 10-11 % экстрактивных веществ. При увеличении числа диффузоров до 14 и изменении режима работы батареи, при котором отбор вытяжки производить не из каждого головного диффузора, а через три, заполненных свежим препаратом, то концентрацию можно повысить близкой до концентрации экстрактивных веществ в сухом препарате (до 30-36%). Полученную ферментную вытяжку фильтруют через асбестовую фильтрмассу, фильтрационный картон или обычную фильтровальную бумагу для отделения механических примесей. После фильтрации вытяжку подвергают диализу. Диализ - это диффузия растворенных веществ через мембрану (полупроницаемую перегородку), которая проницаема только для тех веществ, размеры молекул которых меньше диаметра ее пор.

Ферменты - это специфические белки, т.е. высокомолекулярные соединения, они не проходят через поры перегородки, другие же растворенные низкомолекулярные вещества проходят через нее. Диализ осуществляется в специальном сосуде - диализаторе током воды в течение 20-24 ч до удаления из ферментной вытяжки 55-60% балластных растворимых веществ. В качестве мембраны используют растительный пергамент, целлофан отдельных марок и хлопчатобумажную или шелковую ткань, пропитанную специальным составом из желатина, двухромовокислого аммония и глицерина. При том, если не требуется высокая степень очистки, диализ не применяется, но при этом концентрация сухих веществ в вытяжке не должна превышать 20%.

В специальном аппарате-осадителе выделяют ферменты в осадок добавлением этилового или изопропилового спирта. Для осаждения ферментов требуется 70%-ный этиловый или 55%-ный изопропиловый спирт. При этом расход 95%-ного этилового спирта составляет 2,8 объема на один объем ферментной массы. Расход 95%-ного изопропилового спирта на тот же объем составляет 1,4 объема. Осаждение ферментов изопропиловым спиртом в пять раз дешевле, чем осаждение этиловым.

Выпавший осадок ферментов отделяют на центрифуге и высушивают. Сушку производят при обычном атмосферном давлении и температуре не выше 40°С в течение 6-8 ч. Влажность высушенного ферментного препарата - 8-10%. Его измельчают на мельнице и расфасовывают в герметически закрывающуюся стеклянную или жестяную тару. Спирт, оставшийся после осаждения, перегоняют для укрепления с целью повторного использования. Технологическая схема получения очищенного ферментного препарата показана на рис. 4.4.

Выход очищенных ферментных препаратов составляет 2-2,5% к количеству взятой сухой культуры гриба Аспергиллюс оризе. В результате очистки в комплексных препаратах концентрация ферментов по сравнению с сухой культурой повышается в 25-50 раз.

Известны и другие схемы получения очищенных ферментных препаратов. Балластные примеси, содержащиеся в ферментной вытяжке гриба Аспергиллюс оризе, можно удалять повышением pH до 8,2-8,6 с последующим центрифугированием образовавшегося осадка: добавление к вытяжке 0,1-0,2% хлористого кальция способствует выпадению осадка. После отделения его степень чистоты препарата увеличивается в 2-2,5 раза.

Ферментную вытяжку после диализа можно подвергнуть выпариванию под вакуумом (температура кипения не выше 32°С). Полученный сироп высушивают до образования порошка.

Кроме очищенных комплексных ферментных препаратов можно получить отдельно амилолитические и протеолитические ферменты. Из ферментной вытяжки сухой культуры плесневого гриба Аспергиллюс оризе после диализа сначала слабым раствором этилового спирта осаждают протеолитические ферменты, отделяют их на центрифуге, а затем в оставшемся растворе более крепким спиртом осаждают амилолитические ферменты. Осадки ферментов после отделения на центрифугах высушивают, измельчают и упаковывают.

Можно также для получения очищенных ферментных препаратов, обладающих одним видом ферментной активности, подобрать такие виды и штаммы микроорганизмов, которые продуцируют, главным образом, амилолитические или протеолитические ферменты.

Так, например, плесневый гриб Аспергиллюс флявус обладает высокой протеолитической способностью и некоторые штаммы его не образуют амилолитических ферментов. Концентрированные ферментные препараты могут выпускаться в виде сгущенного ферментного сиропа. Для этого полученную после диализа ферментную вытяжку упаривают в выпарном аппарате под вакуумом и затем разливают в трех-, пятикилограммовые бидоны.

Очищенные ферментные препараты можно получить и из глубинных культур микроорганизмов. Однако выделение ферментов из глубинных культур на барде затруднительно, так как в ней остается много веществ, не используемых грибом.

Для получения очищенных ферментных препаратов глубинную культуру гриба выращивают на искусственной питательной среде. Так, для получения препаратов амилазы рекомендуется питательная среда из кукурузной муки, азотнокислого натрия и других солей. При выращивании на этой среде гриба Аспергиллюс оризе (штамм 3-9-15) в нем образуются амилолитические ферменты и отсутствуют протеолитические. Выделение очищенного препарата из такой культуры проще, чем из поверхностной. Вся амилаза содержится в культуральной жидкости, и мицелий гриба отделяют фильтрованием. Отфильтрованный раствор упаривают под вакуумом (32-33°С) и осаждают ферменты из упаренного раствора этиловым спиртом. Выпавший ферментный осадок отделяют на центрифуге, промывают спиртом и высушивают в сушилке под вакуумом.

Литература:

1. Климовский Д.H., Смирнов В.А., Стабников В.Н. Технология спирта. - М.: Пищевая промышленность, 1967. - С.173-189.

2. Фертман Г.И., Шойхет М.И, Чепелева А.С. Технология бродильных производств. - М.: Высшая школа, 1966,- С. 75-89.

3. Халаим А.Ф. Технология спирта. - М.: Пищевая промышленность, 1972. - С. 51-61.

4. Фертман Г.И., Шойхет М.И, Технология спиртового и ликероводочного производства. - М.: Пищевая промышленность, 1973. - С.99-106.