Биологический метод микробиологической диагностики, назначение и принцип метода.

Заражение экспериментальных животных может производиться в целях:

1. идентификации микроорганизмов по вирулентности;

2. выделения чистой культуры возбудителя из различных материалов и ее идентификации;

3. воспроизведения и изучения инфекционного процесса;

4. испытания лечебного эффекта химиотерапевтических и иммунологических препаратов.

5. получения иммунобиологических лечебно-профилактических и диагностических препаратов и др.

В зависимости от цели исследования заражают различных животных (кроликов, морских свинок, белых мышей, белых крыс и др.) различными способами: накожно, внутрикожно, подкожно, внутримышечно, внутривенно, перорально, интраназально, внутритрахеально, интрацеребрально и внутрибрюшинно.

Внутрибрюшинное заражение белых мышей с целью:

1. идентификации выделенной чистой культуры S.aureus по вирулентности;

2. установления формы инфекции по происхождению, локализации, длительности течениия, количеству возбудителя и др.

План работы первого этапа:

1. Суточную агаровую культуру S.aureus проверяют на чистоту

2. (готовят мазок и окрашивают по Граму).

3. Стерильным физ. раствором смывают культуру и готовят микробную взвесь соответствующей оптическому стандарту мутности (1мл – 1 млрд.мкр.тел)

4. Взвесь микробов (0,5 мл) набирают в шприц.

5. Заражают внутрибрюшинно белую мышь. Берут мышь левой рукой за хвост, фиксируют её в растянутом состоянии брюшком вверх, головой вниз, чтобы кишечник переместился к диафрагме. В левой нижней трети живота делают прокол кожи под острым углом, затем устанавливают шприц под прямым углом, толчкообразным движением прокалывают брюшину и вводят содержимое шприца.

6. Зараженных животных маркируют и отправляют в лабораторию. Инструменты до и после заражения стерилизуют кипячением.

Второй этап. Вскрытие трупа с целью обнаружения возбудителя и идентификации путем микроскопического исследования и выделения чистой культуры.

План исследования:

Мышь фиксируют брюшком вверх в специальной подставке. Шерсть и кожу обрабатывают спиртом.

1. Макроскопическое исследование. Тщательно осматривают наружные покровы. Затем делают разрез кожи по прямой линии от нижней челюсти до лобка и боковые разрезы к лапкам. Отсепаровывают кожу в обе стороны от разреза. Отметить состояние подкожной клетчатки и лимфатических узлов. Обращают внимание на внешний вид лёгких, сердца.Осмотреть органы брюшной полости, характер экссудата, величину, цвет и консистенцию печени и селезенки.

2. Микроскопическое исследование. Приготовить следующие мазки и окрасить их методом Грама:
а) мазок из крови сердца;
б) мазок-отпечаток легкого;
в) мазок из асцитической жидкости (экссудата);
г) мазок- отпечаток печени;
д) мазок- отпечаток селезенки.

При микроскопии отмечают присутствие микроба-возбудителя в различных органах и тканях и по результатам исследования мазков оформить предварительное заключение.

3. Бактериалогические исследование.

Параллельно с приготовлением мазков сделать посевы из тех же органов на 5 пробирок с МПБ:

а) для посева крови из сердца участок его поверхности прижигают раскалённым скальпелем и через прижжённый участок вводят капилляр стерильной пастеровской пипетки в полость сердца. Затем каплю крови из пипетки выдувают в пробирку с МПБ и на предметное стекло для приготовления мазка (мазок фиксируют спиртом в течение 3-5 минут);

б) из ткани лёгкого делают посев кусочка ткани в МПБ и приготовляют мазок – отпечаток;

в) разрезают брюшную стенку ножницами от диафрагмы до лобка. Обращают внимание на наличие экссудата, который собирают пастеровской пипеткой и засевают в МПБ. Каплю экссудата наносят на предметное стекло для окрашивания. Для приготовления мазков-отпечатков вырезают из печени, селезенки небольшие кусочки ткани, берут их пинцетом и прикасаются к предметному стеклу поверхностью разреза. Мазки-отпечатки фиксируют термическим способом;

г)результат посевов учитывают на следующий день после инкубации в термостате. Труп животного после вскрытия подлежит уничтожению;

д) учесть результаты посевов на питательных средах и оформить окончательное заключение

17.Методы выявления факторов вирулентности (адгезивности, капсулообразования, антигенов-ингибиторов фагоцитоза, токсигенности, α-, β-, γ-энтеро -и тиолзависимых гемолизинов, ферментов агрессии: плазмокоагулазы, лизоцима, гиалуронидазы, лецитовителлазы и др.).

Адгезивность. Адгезины - поверхностные структуры микроорганизмов (пили, поверхностные белки, тейховые кислоты), способствующие прикреплению возбудителя к клеткам организма и являются обязательными, специфическими факторами, реализующими патогенность микроба на начальном этапе развития инфекционного процесса. Адгезивность оценивается по способности бактерий прилипать к эритроцитам. Эритроциты крови 1 группы человека смешивают на предметном стекле с чистой исследуемой культурой и инкубируют 30 минут при 37^оС. Делают мазок и подсчитывают индекс адгезии (соотношение количества микробов, адгезированных на эритроцитах к количеству эритроцитов, участвующих в адгезии).

Капсулообразование. Капсула у многих бактерий маскирует микробы от фагоцитов или подавляет фагоцитоз. Для определения капсулообразования применяются следующие методы:

1) бактериоскопический метод. Мазки готовят из патологического материала (мокрота, гной, спинномозговая жидкость) и окрашивают по Граму. Например, S. рneumonia - грамположительные диплококки, окруженные неокрашенной капсулой. Можно покрасить по Бурри-Гинсу. Капсулообразующими являются также C.perfringens, К.рneumonia, B. anthracis, Y. pestis и др;