Классификация клеточных культур, применяемых в вирусологии.

Культуры клеток готовят из тканей живот­ных или человека. Культуры подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые.

Неперевиваемые Приготовление складывает­ся из нескольких последовательных этапов: измельчения ткани, разъединения клеток путем трипсинизации, отмывания получен­ной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием (в виде мелких частиц) клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост. Используются в течение одной генерации.

Перевиваемые культуры в отличие от первичных адаптированы к условиям, обеспечивающим им постоянное существование in vitro, и сохра­няются на протяжении нескольких десятков пассажей.

Перевиваемые однослойные культуры клеток приготов­ляют из злокачественных и нормальных линий клеток, обладаю­щих способностью длительно размножаться in vitro в определен­ных условиях. К ним относятся злокачественные клетки HeLa, первоначально выделенные из карциномы шейки матки, Нер-3 (из лимфоидной карциномы), а также нормальные клетки ам­ниона человека, почек обезьяны и др.

К полуперевиваемым культурам относятся диплоид­ные клетки человека. Они представляют собой клеточную систе­му, сохраняющую в процессе 50 пассажей (до года) диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток использу­емой ткани. Диплоидные клетки человека не претерпевают зло­качественного перерождения и этим выгодно отличаются от опухолевых.

О размножении (репродукции) вирусов в культуре клеток судят по цитопатическому действию (ЦПД), кото­рое может быть обнаружено микроскопически и характеризуется морфологическими изменениями клеток.

Методы заражения куриного эмбриона. Цель. Этапы.

Заражение куриного эмбриона в аллантоисную полость с целью

выделения чистой культуры вируса гриппа А и его идентификации.

1-й этап. Выделение вируса (культивирование вируса).

Для заражения используют куриные эмбрионы 8-14 дневного возраста.

Ход работы:

1) определение жизнеспособности эмбриона в овоскопе и отмечают карандашом на скорлупе границы воздушной камеры;  

2) яйцо помещают на подставку в вертикальном положении так, чтобы воздушный мешок находился наверху;

3)стерилизация скорлупы на тупом конце яйца в такой последовательности: спиртом, 2 % йодной настойкой ещё раз спиртом и обжиганием;

4) над центром воздушного мешка делают прокол скорлупы с помощью препаровальной иглы;

5) Пастеровской пипеткой вводят вируссодержащего материала на глубину 2-3 мм ниже границы воздушной камеры;

6) отверстие в скорлупе заклеивают лейкопластырем;

7) инкубация эмбриоа в термостате в течение 2-3 суток при 37⁰ С.

2-й этап. Идентификация выделенной чистой культуры вируса.

Ход работы:

1) яйцо устанавливают на подставке так, чтобы воздушное пространство было наверху;

2) обработка скорлупы последовательно спиртом, йодом, опять спиртом и обжиганием;

3) осторожно снимают лейкопластырь, рассекают и сбрасывают скорлупу, определяют гибель эмбриона, отсасывают аллантоисную жидкость и разливают в пробирки;

4) идентификация вируса проводится по гемагглютинирующей активности (по способности склеивать куриных эритроцитов) в реакции гемагглютинации. 

Реакция гемагглютинации

Вирусы, обладающие гемагглютинирующими свойствами (имеющие гемагглютинин – гликопротеид суперкапсида), способны гемагглютинировать эритроцитов различных животных. Например, вирусы гриппа – куриных эритроцитов.

Компоненты реакции:

1) исследуемый материал – аллантоисная жидкость (гемагглютинин вируса гриппа?);

2) 5% суспензия куриных эритроцитов;

3) физиологический раствор.

Существует два способа постановки реакции: капельный способ на стекле и объемный способ в пробирке.

Капельный способ на стекле:

Опыт:1 капля аллантоисной жидкости + 1 капля 5% суспензии куриных эритроцитов.

Контроль: 1 капля физ. раствора + 1 капля 5% суспензии куриных эритроцитов. Хорошо перемешать сначала контрольную каплю, затем- опытную.

Наличие гемагглютинации (выпадение хлопьев красного цвет) в опыте при ее отсутствии в контроле (гомогенное покраснение) указывает на содержание вируса гриппа в исследуемом материале.

Гемагглютинация – это склеивание эритроцитов под влиянием гемагглютинина вируса.

Вид вируса гриппа (А,В,С) дифференцируют по антигенной структуре с помощью РСК, ИФА, а серотип – РТГА.

Окончательную идентификацию также можно провести по генетической структуре (ПЦР).

51. Индикация вирусов по цитопатическому действию, по бляшкообразованию и внутриклеточным включениям. Реакции гемагглютинации и гемадсорбции.