Идентификация С.р erfringens по токсигенности в р еакции нейтрализации токсина антитоксином (РН) на мышах

РН токсина антитоксической сывороткой на животных основан на способности специфических антител антитоксинов подавлять биологическую активность бактериальных экзотоксинов.

Компоненты:

1) исследуемый материал (экзотоксин С.рerfringens);

2) диагностические сыворотки с антитоксинами против С.рerfringens, C. novyi, C. septicum, C. histolyticum и др.;

3) мыши – индикатор реакции.  

Диагностические сыворотки получают путем гипериммунизации кроликов анатоксинами - инактивированными эзотоксинами (формальдегидом), но сохранившими свои иммуногенные свойства, то есть способность индуцировать выроботку антител.

Принцип метода. К диагностическим видоспецифическим антитоксическим сывороткам добавляют исследуемого токсина, выдерживают в течение определенного времени и вводят внутрикожно животным. Учет реакции проводится по живой мышке.

С. рerfringensпродуцирует шесть типов экзотоксина, различающихся по антигенной структуре (А, В, С, D, Е, F). Идентифицируют их с помощью диагностических типоспецифических сывороток.

38. Особенности антивирусного иммунитета: неспецифические и специфические факторы.

 

Особенность иммунологии вирусных инфекций обусловлена уникальными особенностями биологии их возбудителей, принад­лежащих к агентам молекулярной неклеточной организации. Все вирусы представляют собой строгие внутриклеточные паразиты, отличающиеся механизмами репродукции и взаимодействия с чувствительными клетками от клеточных микроорганизмов.

При вирусных инфекциях, как и при бактериальных, после переболевания в организме формируется иммунитет различной на­пряженности и длительности. Следует отметить, что при попада­нии вируса в организме не всегда происходят иммунологические реакции.

В основе механизмов такой невосприимчивости (врожденно­го иммунитета — видового, наследственного, генетического) к оп­ределенным возбудителям лежит отсутствие в клетках рецепторов и субстратов, необходимых для взаимодействия вирусов, наличие веществ, блокирующих репродукции вирусов.

 

Защитные приспособления, или факторы противовирусного иммунитета, подразделяют на неспецифические и специфичес­кие, которые разнообразны по своей природе и механизму дей­ствия.

Неспецифический противовирусный иммунитет. Создание имму­нитета обеспечивают факторы неспецифической защиты: 1) об­щие физиологические; 2) гуморальные; 3) клеточные.

Перечисленные факторы обеспечивают защиту микроорганиз­ма против вирусов на молекулярном, клеточном и организменном уровнях, которые неразрывно связаны между собой.

Общие физиологические факторы. Для проникно­вения в восприимчивые клетки и ткани вирусу необходимо пре­одолеть защитные барьеры.

Кожно-слизистые барьеры выдерживают первую атаку вирусов. Неповрежденные кожа и слизистая оболочка служат не только ме­ханической преградой, но и являются стерилизующим фактором.

Если вирусы преодолели кожные и слизистые барьеры, то на­чинается их массивное проникновение в ткани. В инфицирован­ный участок быстро прибывает огромная масса фагоцитов, и та­ким образом создается защитный вал вокруг воспалительного очага, при этом ограничивается распространение микробов в сосед­ние ткани и кровь.

В создании иммунитета участвуют и такие общефизиологичес­кие факторы, как температура тела и выделение вируса из орга­низма различными секрециями. При повышении температуры тела усиливаются процессы иммуногенеза, ускоряется обмен ве­ществ, усиливается продукция интерферона, что в совокупности способствует выздоровлению. Повышение температуры тела вы­зывает непосредственную инактивацию внеклеточного вируса и способствует подавлению репродукции внутри клетки.

 

Выделение вирусов в ок­ружающую среду с мочой и другими экскретами способствует бо­лее быстрому восстановлению относительного постоянства внут­ренней среды организма, нарушаемого вирусной инфекцией.

 

Гуморальные факторы. Неспецифическую защиту орга­низма обеспечивают пропердин, ингибиторы в сыворотке крови, гормоны.

Пропердин (гамма-глобулин) содержится в нормальной сыво­ротке крови и принимает участие в нейтрализации вирусов. Ак­тивность проявляется за счет не самого пропердина, а системы пропердина (комплемента и двухвалентных ионов магния).

Ингибиторы — это неспецифические противовирусные веще­ства белковой природы, которые присутствуют в нормальной сы­воротке крови, секретах эпителия слизистых оболочек дыхатель­ного и пищеварительного трактов, в экстрактах органов и тка­ней. Они обладают способностью подавлять активность вирусов вне чувствительной клетки: при нахождении вируса в крови и жид­костях. Ингибиторы подразделяют на термолабильные (теряют свою активность при прогревании сыворотки крови при 60...62 °С в течение 1 ч) и термостабильные (выдерживают нагревание до 100 °С). Ингибиторы обладают универсальной вируснейтрализующей активностью в отношении мно­гих вирусов.

Механизм действия ингибиторов заключается в соединении их с вирусами, вызывая нейтрализацию вирусных рецепторов, что выражается в понижении их физико-химических адсорбционных свойств. В результате вирусы теряют способность адсорбироваться на поверхности чувствительных клеток и проникать в них; вирус­ные частицы отторгаются с поверхности чувствительных клеток.

 

Клеточные факторы. В неспецифическом противови­русном иммунитете участвуют фагоцитирующие клетки (микро- и макрофаги).

Макрофаги — это полиморфная группа клеток, активно фаго­цитирующих чужеродный материал, попавший в кровоток: моно­циты крови, клетки костного мозга, купферовские клетки печени, гистиоциты, макрофаги селезенки, лимфатических узлов и сероз­ных полостей.

Фагоцитозу возбудителей макрофагами способствуют специ­фические антитела, оказывающие опсонирующие и агглютиниру­ющие действия на вирусы. Кроме того, фагоциты являются проду­центами антител и интерферона.

Роль лейкоцитов в противовирусном иммунитете малоэффек­тивна (незначительна). Вирусы адсорбируются на лейкоцитах и поглощаются ими, но последующего разрушения их в клетках не происходит: весь процесс останавливается на стадии незавершен­ного фагоцитоза. Попытки в экспериментальных условиях пере­вести незавершенный фагоцитоз в завершенный не дали положи­тельных результатов. Неспособность макрофагами переваривать вирусы — одна из основных особенностей механизма противови­русного и противобактериального иммунитета. Однако в противо­вирусном иммунитете фагоцитозу не отводится существенная роль.

 

Подавление процесса репродукции одного вируса другим в жи­вых клетках называется виругенией.

Материальной ос­новой служит особое вещество — интерферон, образующийся клеткой в ответ на проникновение в нее вируса.

Его продуцируют практически все клетки организма, но наиболее активно клетки РЭС (особенно селезен­ки) и лейкоциты (макрофаги и лимфоциты). Образование интер­ферона в клетке обусловлено двумя моментами: устойчивостью клетки к вирусу и степенью вирулентности вируса. Если клетка устойчива к вирусу и вирус маловирулентный, то в клетке начина­ется синтез интерферона. Интерферон подавляет синтез вирусных нуклеаз и активирует синтез другого клеточного белка, обладаю­щего антивирусной активностью. Причем местами такого дей­ствия интерферона могут быть вирусная информационная РНК или клеточные рибосомы. Но если клетка чувствительна к вирусу и последний достаточно вирулентен, то клетка синтезирует вирус­ные компоненты; начинается репродукция вирусных частиц.

В отличие от антител интерферон обладает широким спектром антивирусного действия; предохраняет клетки от заражения не только гомологичным вирусом, но и гетерологичными вирусами.

Интерферон адсорбируется другими клетками, и по мере на­ступления адсорбции развивается устойчивость клеток к зараже­нию вирусом. Он не инактивирует внеклеточный вирус ин витро, что подтверждается сохранением инфекционности последнегопосле смешивания его с интерфероном, а также препятствует ад­сорбции вируса клеткой и лишь с наступлением интерференции предотвращает накопление вируса в клетке и развитие цитопати- ческого эффекта. При латентных инфекциях наступает равнове­сие между продукцией клетками вируса и интерферона. Внешне такие клетки не отличаются от здоровых.

Таким образом, антивирусное действие интерферона сводится в конечном счете к превращению инфицированной клетки в сис­тему, в которой репродукция вируса либо невозможна, либо по­давлена.

Специфический противовирусный иммунитет. Специфическая за­щита животных от вирусов осуществляется иммунной системой, которая обладает уникальной способностью распознавать множе­ство разнообразных агентов (микроорганизмы, в том числе и ви­русы, токсины и др.) — антигенов и вырабатывать в ответ на это распознавание специфические антитела и сенсибилизированные лимфоциты.

Иммунные механизмы обеспечивают: 1) гуморальные факторы; 2) клеточные факторы.

 

Специфические противовирусные антитела способны взаимодействовать только с внекле­точным вирусом, внутриклеточные структуры прижизненно для них недоступны. Антитела нейтрализуют вирусную частицу, препятствуя ее адсорбции на клетке-мишени, инфици­рованию и генерализации процесса, а также связывают вирусные белки и нуклеиновые кислоты, которые попадают в межклеточ­ную среду и секреты после разрушения за­раженных вирусами клеток. Образовавшиеся иммунные комплексы элиминируются пу­тем иммунного фагоцитоза. Специфическое связывание антител с вирусными белками, экспрессированными на ЦПМ инфициро­ванных клеток, индуцирует цитотоксическую активность естественных киллеров (см. гл. 11, разд. 11.3.1).

Клетки, инфицированные вирусом и при­ступившие к его репликации, экспрессируют вирусные белки на цитоплазматической мембране в составе молекул антигенов гистосовместимости — МНС I класса (см. гл. 10, разд. 10.1.4.2). Это является сигналом для активации Т-киллеров, которые распознают зараженные вирусом клетки и уничтожают их (см. гл. 11, разд. 11.3.2).

 

 

39. Иммунобиологические препараты. Вакцины: живые, инактивированные (убитые), субклеточные и субвирионные (химические), анатоксины, синтетические, полусинтетические, рекомбинантные, ассоциированные вакцины (поливакцины и комбинированные) и др.; способы приготовления, достоинства, недостатки. Адъюванты.

 

Иммунобиологические препараты имеют сложный состав, отличаются по своей природе, способам получения и применения, целе­вому назначению. Однако их объединяет то, что они действуют или на иммунную систему, или через иммун­ную систему, или же механизм их действия основан на иммунологических принципах.

Действующим началом в ИБП являются или антигены, полученные тем или иным способом, или антитела, или микробные клетки и их дериваты, или биологически ак­тивные вещества типа иммуноцитокинов, иммунокомпетентные клетки и другие иммунореагенты.

 

Живые вакцины — препараты из аттенуированных (ослабленных) либо генетически изменённых патогенных микроорганизмов, а также близкородственных микробов, способных индуцировать невосприимчивость к патогенному виду (в последнем случае речь идёт о так называемых дивергентных вакцинах). Поскольку все живые вакцины содержат микробные тела, то их относят к группе корпускулярных вакцинных препаратов. Иммунизация живой вакциной приводит к развитию вакцинального процесса, протекающего у большинства привитых без видимых клинических проявлений. Основное достоинство живых вакцин— полностью сохранённый набор Аг возбудителя, что обеспечивает развитие длительной невосприимчивости даже после однократной иммунизации. Живые вакцины обладают и рядом недостатков. Наиболее характерный — риск развития манифестной инфекции в результате снижения аттенуации вакцинного штамма. Подобные явления более типичны для противовирусных вакцин (например, живая полиомиелитная вакцина в редких случаях может вызвать полиомиелит вплоть до развития поражения спинного мозга и паралича).

 

Инактивированные вакцины в качестве действующего начала включают убитые хи­мическим или физическим методом культу­ры патогенных бактерий или вирусов (цельноклеточные, цельновирионные вакцины) Для инактивации бактерий и вирусов применяют формальдегид, спирт, фенол или температурное воздействие, ультрафиолето­вое облучение, ионизирующую радиацию.

Получают инактивированные вакцины путем выращивания на искусственных питательных

средах патогенных бактерий или вирусов, ко­торые затем подвергают инактивации, очистке, конструи­рованию в виде жидкого или лиофильно вы­сушенного препарата. В препарат обязательно добавляют консервант, иногда — адъюванты.

 

Субклеточные и субвирионные вакцины состоят из антигенных комплексов, выделенных из бактерий или вирусов после их разрушения. Такие вакцины используют с применением адъюванта, чтобы замедлить всасывание из места введения. Для выделения из бактерий и вирусов анти­генных комплексов (гликопротеинов, ЛПС, белков) применяют трихлоруксусную кислоту, фенол, ферменты, изоэлектрическое осажде­ние, ультрацентрифугирование, ультрафиль­трацию, хроматографию и другие физические и химические методы.

 

Анатоксины: дифтерийный, столбнячный, ботулинический (типов А, В, Е), гангренозный (перфрингенс, нови и др.), стафилококко­вый, холерный.

Принцип получения анатоксинов состоит в том, что образующийся при культивировании соответствующих бактерий токсин в молеку­лярном виде превращают в нетоксичную, но сохраняющую специфическую антигенность форму — анатоксин путем воздействия 0,4% формальдегида и тепла (37 °С) в течение 3—4 недель. Полученный анатоксин подвергают очистке и концентрированию физическими и химическими методами для удаления балластных веществ, состоящих из продуктов бактерий и питательной среды, на которой они выращивались. К очищенному и концентрированному анатоксину для повышения его иммуногенности добавляют адъюванты.

 

Синтетические вакцины

Принцип конструирования вакцин включает синтез или выделение нуклеиновых кислот или полипептидных последовательностей, образующих Aг-детерминанты, распознаваемых нейтрализующими AT. Непременные компоненты таких вакцин — сам Аг, высокомолекулярный носитель (винилпирролидон или декстран) и адъювант (повышающий иммуногенность вакцин).

 

Синтетические пептидные вакцины - это препараты, содержащие искусственно синтезированные короткие пептиды, имитирующие небольшие участки протективных антигенов вируса, способные вызывать специфический иммунный ответ организма и защитить его от конкретного заболевания. Идентификация основных антигеных детерминант протективных антигенов многих вирусов позволила синтезировать антигенноактивные пептиды.

 

Полусинтетические вакцины представляют собой сложный комплекс, состоящий из антигена или его детерминанты, носителя в виде высокомолекулярного полимера и адъюванта.

В настоящее время такие полусинтетические экспериментальные вакцины получены против гриппа, чумы, туляремии. Методом химического синтеза получены антигены ВИЧ, которые уже используются в диагностической системе «Рекомбинант ВИЧ».

 

Рекомбинантные вакцины содержат Аг возбудителей, полученные с использованием методов генной инженерии, и включают только высокоиммуногенные компоненты, способствующие формированию защитного иммунитета. Возможны несколько вариантов создания генно-инженерных вакцин.

• Внесение генов вирулентности в авирулентные или слабовирулентные микроорганизмы.

• Внесение генов вирулентности в неродственные микроорганизмы с последующим выделением Аг и его использованием в качестве иммуногена.

• Искусственное удаление генов вирулентности и использование модифицированных организмов в виде корпускулярных вакцин.

Ряд современных противовирусных вакцин сконструирован путём введения генов, кодируюших основные Аг патогенных вирусов и бактерий в геном вируса осповакцины (HBsAg вируса гепатита В) и непатогенных для человека сальмонелл (HBsAg вируса гепатита В и Аг токсина столбнячной палочки). Другим примером служит введение генов возбудителя туберкулёза в вакцинный штамм БЦЖ, что придаёт ему большую активность в качестве дивергентной вакцины. Такие препараты известны как векторные вакцины.

 

Ассоциированные вакцины – препараты, включающие несколько разнородных антигенов и позволяющие проводить иммунизацию против нескольких инфекций одновременно. Если в препарат входят однородные антигены, то такую ассоциированную вакцину называют поливакциной. Если же ассоциированный препарат состоит из разнородных антигенов, то его целесообразно называть комбинированной вакциной. Они представляют собой препараты, состоящие из микробного антигенного компонента (обычно выделенного и очищенного или искусственно синтезированного антигена возбудителя) и синтетических полиионов (полиакриловая кислота и другие) - мощных стимуляторов иммунного ответа. Содержанием этих веществ они и отличаются от химических убитых вакцин.

Примером поливакцины можно считать живую полиомиелитную поливакцину, содержащую аттенуированные штаммы вируса полиомиелита I, II, III типов. Примером комбинированной вакцины является АКДС, куда входят инактивированная корпускулярная коклюшная вакцина, дифтерийный и столбнячный анатоксин.

Комбинированные вакцины применяются в сложной противоэпидемической обстановке. В основе их действия лежит способность иммунной системы отвечать на несколько антигенов одновременно.

 

Под иммунологическими адъювантами подразумевают любые вещества, действующие неспецифически и повышающие специфический иммунный ответ на антигены. Поскольку многие вирусные вакцины (особенно компонентные) вызывают слабые иммунные реакции, стали использовать адъюванты, добавление которых дало возможность в различной степени возместить этот недостаток. Адъюванты функционируют как депо антигена, как иммуностимуляторы, и как иммуномодуляторы или как организаторы антигена в дискретные частицы. Многие адъюванты сочетают комбинированное действие двух и более из этих функций. Об иммуностимулирующей и иммуномодулирующей функции адъювантов свидетельствует повышение титра антител, возрастание активности Тц- и/или Тх-клеток. Различные цитокины действуют так же как адъюванты.

 

40. Календарь прививок

Возраст	Наименование прививки
Новорожденные (в первые 12 часов жизни)	Первая вакцинация против вирусного гепатита В
Новорожденные (3-7 дней)	Вакцинация против туберкулеза
1 месяц	Вторая вакцинация против вирусного гепатита В
3 месяца	Первая вакцинация против дифтерии, коклюша, столбняка, полиомиелита
4,5 месяца	Вторая вакцинация против дифтерии, коклюша, столбняка, полиомиелита
6 месяцев	Третья вакцинация против дифтерии, коклюша, столбняка, полиомиелита. Третья вакцинация против вирусного гепатита В.
12 месяцев	Вакцинация против кори, краснухи, эпидемического паротита.
18 месяцев	Первая ревакцинация против дифтерии, коклюша, столбняка, полиомиелита
20 месяцев	Вторая ревакцинация против полиомиелита
6 лет	Ревакцинация против кори, краснухи, эпидемического паротита.
7 лет	Ревакцинация против туберкулеза. Вторая ревакцинация против дифтерии, столбняка
13 лет	Вакцинация против краснухи (девочки). Вакцинация против вирусного гепатита В (ранее не привитые).
14 лет	Третья ревакцинация против дифтерии и столбняка. Третья ревакцинация против полиомиелита.
Взрослые	Ревакцинация против дифтерии, столбняка каждые 10 лет от момента последней ревакцинации.

 

41.Лечебно-профилактические иммунные сыворотки антитоксические, антибактериальные, антивирусные) и иммуноглобулины (гомологичные и гетерогенные, нормальные и направленного действия); принципы получения, очистки и титрования).

 

Лечебно-профилактические сыворотки применяют для создания пассивного искусственно приобретенного иммунитета и делят на противовирусные, антибактериальные и антитоксические.

Преимущество сывороток перед вакцинами в том, что они сразу же после введения создают иммунитет (12 – 24 час). Недостаток– непродолжительный иммунитет, т.к. антитела - чужеродные белки, которые быстро (через 1 – 2 недели) выводятся из организма.

Лечебно-профилактические сыворотки получают из крови гипериммунизированных животных (лошадей)и из крови людей (донорской, плацентарной, абортивной), переболевших или иммунизированных.

 

Для получения антитоксических сывороток проводят гипериммунизацию (многократное введение) лошадей токсинами. Иммунизацию проводят подкожно или внутривенно возрастающими дозами антигена с определенными интервалами времени между инъекциями. Вначале вводят анатоксин, а через 4 – 5 дней – токсин. Антитоксические сыворотки используют для создания антитоксического иммунитета, т.е. для лечения и профилактики токсинемических инфекций (ботулизма, столбняка, газовой гангрены, дифтерии).

Для получения антибактериальных сывороток проводят гипериммунизацию вакцинными штаммами бактерий или убитыми бактериями. Они содержат антитела с агглютинирующими и лизирующими свойствами. Это нетитруемые препараты. Малоэффективны.

Для получения противовирусных сывороток проводят гипериммунизацию штаммами вирусов.

Сыворотки очищают различными методами, концентрируют, стерилизуют и определяют ее активность (титр антител).

Активность антитоксических сывороток выражают в Международных единицах (МЕ). Активность сыворотки отражает ее способность нейтрализовать определенную дозу токсина. Это условно взятая величина для каждого вида сыворотки. Например, для дифтерийной сыворотки 1 МЕ – это наименьшее количество сыворотки, которое нейтрализует 100 DLM дифтерийного токсина для морской свинки.

Сыворотки представляют собой прозрачные жидкости, бледно- желтого цвета. Выпускают в ампулах. Сыворотки, так же, как и вакцины, после производства проходят государственный контроль в соответствии с инструкциями Министерства здравоохранения. Сыворотки контролируют на стерильность, безвредность, количество белка, прозрачность и активность (титр антител). Сыворотки вводят подкожно, внутримышечно, реже - внутривенно или в спинномозговой канал. Вводят сыворотки по методу Безредке для предупреждения анафилактического шока и сывороточной болезни.

Из сывороток получают иммуноглобулины путем водно-спиртового извлечения (очистки).

Иммуноглобулины – это очищенные и концентрированные иммунные сыворотки.

Иммуноглобулины, как и иммунные сыворотки бывают гомологичными и гетерологичными. Гомологичные получают из крови людей, гетерологичные – из крови животных. Иммуноглобулины из крови человека бывают 2-х видов: 1) противокоревой (нормальный) иммуноглобулин – получают из донорской, плацентарной или абортивной крови здоровых людей, которая содержит антитела против вируса кори, вирусов гриппа, гепатита, полиомиелита, против коклюша и некоторых других бактериальных и вирусных инфекций; 2) иммуноглобулины направленного действия – получают из крови переболевших людей и добровольцев, которых иммунизируют против определенной инфекции; они содержат повышенные концентрации специфических антител и применяются с лечебной целью; получают иммуноглобулины направленного действия против гриппа, бешенства, оспы, клещевого энцефалита, столбняка и стафилококковых инфекций.

Гетерологичные иммуноглобулины: иммуноглобулины лошадиные против бешенства (антирабический g-глобулин), клещевого энцефалита, лихорадки Эбола, японского энцефалита, сибирской язвы; иммуноглобулины из сыворотки крови волов для лечения лептоспироза.

Гомологичные сывороточные препараты широко применяют для профилактики и лечения вирусного гепатита, кори, для лечения ботулизма, столбняка, стафилококковых инфекций, клещевого энцефалита, гепатита В. и др.

Гетерологичные сыворотки – это лошадиные сыворотки против ботулизма, газовой гангрены, дифтерии, столбняка.

Применение гомологичных сывороток и иммуноглобулинов предпочтительнее (лучше), так как антитела более длительно находятся в организме (4 – 5 недель) и не вызывают сильных побочных реакций, как гетерологичные. Гетерологичные препараты быстро выводятся из организма (через 1 – 2 недели) и вызывают побочные эффекты. Они имеют строго ограниченное применение из-за опасности аллергических осложнений