Доказательство принадлежности «РНК ВИЧ» принадлежности экзогенного ретровируса

Группы Монтанье, Галло и Леви утверждали, что особая РНК, которую они выбрали из общей РНК, которая в градиентах плотности сахарозы имела полосу с плотностью 1,16 г / мл, была новой для лимфоцитов и фактически принадлежала экзогенному ретровирусу. Хотя они не представили доказательств, подтверждающих это утверждение, нельзя исключить возможность того, что это действительно могло быть так. Поскольку в настоящее время их утверждение является общепринятым, можно было подумать, что к настоящему времени они или другие исследователи должны были предоставить достаточные подтверждающие доказательства. Кажется, это не так:

6.4.1 Если РНК происходит от ретровируса, эндогенного или экзогенного, то должны существовать доказательства, подтверждающие, что такая РНК является составной частью частиц, которые обладают по крайней мере основными морфологическими и физическими характеристиками ретровирусов, то есть «диаметром 100-120 нм. почкование на клеточных мембранах. Высвободившиеся из клеток вирионы содержат конденсированные внутренние тела (ядра) и усыпаны выступами (шипами, выступами)». (82) На сегодняшний день не только никто не доказал, что«РНК ВИЧ»принадлежит таким частицам, но существует нет доказательств того, что частицы любого вида присутствуют в материале из клеточных культур / сокультур, которые имеют полосы при ретровирусной плотности 1,16 г / мл и из которых выбрана «РНК ВИЧ». Кроме того, хотя частицы были продемонстрированы в культурах,

6.4.2 Если «РНК ВИЧ» является геномом экзогенного ретровируса, то, как и «экзогенные ретровирусы животных», ее можно будет найти в инфицированном материале без необходимости возвращаться к совместному культивированию или митогенным методам. стимулированные культуры. Однако ни одно из явлений, которые, как считается, доказывают существование ВИЧ, не может быть обнаружено, если не использовать митогены или совместные культуры, или и то, и другое (а иногда и дополнительный «шок»), что признают и Монтанье, и Галло (78, 147).

6.4.3 меняется со временем; в одном случае, когда клоны были получены с разницей в 16 месяцев, все клоны, обнаруженные во втором образце, отличались от клонов в первом образце. (156) Также принято, что до 99,9% «геномов ВИЧ» могут быть дефектными. (157)

Основа этой системы классификации: «(а) подтипы приблизительно равноудалены друг от друга в env («звездная»филогения»); (б) филогенетическое дерево env по большей части совпадает с филогенетическими деревьями gag; (c) для определения подтипа последовательности требуются две или более выборки». Однако«проблемы с именованием подтипов возникли по нескольким причинам. Небольшое, но немаловажное количество вирусных последовательностей являются гибридными, кластеризуясь, например, с одним подтипом последовательности в gag и другим подтипом последовательности в env; или, чтобы взять другой пример, кластеризация на разных участках с двумя или более подтипами в env... Именование становится проблематичным, когда возникают сильно расходящиеся формы данного подтипа: такие формы иногда обозначаются A ', B', F 'и т. д. ",

К середине этого года было описано «не менее десяти» (AJ) распространенных основных (M) генотипов с низкой распространенностью, O, ВИЧ-1, и все еще сообщается о новых генотипах. (8,163) По данным исследователей из Генри М. Джексона. Исследовательская лаборатория Фонда и Отдел ретровирологии, Армейский институт Уолтера Рида, США: «Подавляющее большинство генотипических партий ВИЧ-1 основаны на сегментах субгеномной последовательности, обычно составляющих от 2% до 30% генома», а не путем сравнения весь геном. Это связано с тем, что «по-прежнему нецелесообразно получать полноразмерные геномные последовательности изолятов ВИЧ-1 в качестве рутинного метода генотипирования из-за низкого содержания провирусной ДНК ВИЧ-1 в клинических образцах и вирусных культурах на субстрате из PBMC, и относительной неэффективности полимеразной цепной реакции, когда ампликоны становятся большими».«Обозначение вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) охватывает непредвиденную сложность вирусных форм». (163) Согласно исследователям из Лос-Аламосского национального университета Лаборатория, «хотя обозначение подтипа на основе гена или фрагмента гена может быть правильным, рекомбинация могла произойти. Поэтому следует проявлять осторожность, чтобы не переоценить обозначение подтипа. Если кто-то обсуждает обозначение подтипа вирусных изолятов на основе данных, представленных здесь, они должны относиться к обозначению как «B-подобная область петли V3», а не как «подтип-B»»(164). один и тот же человек может быть «инфицирован» более чем одним подтипом. (165) Это означает, что в настоящее время невозможно сказать, каковы различия в последовательностях, как качественные, так и количественные, между разными подтипами ВИЧ-1. Тем не менее, некоторые предполагающие данные все же существуют. В 1993 году исследователи из нескольких организаций «сообщили, что в генотипах AG HIV-1 внутригенотипические расстояния между генотипами составляли в среднем 7%, тогда как межгенотипические расстояния составляли в среднем 14%... Максимальный уровень вариабельности в генотипах ВИЧ-1 все еще значительно ниже наблюдаемого. для области оболочки ВИЧ-1». (166) Два штамма ВИЧ-1, обозначенные как ANT70 и MVP5180, были выделены в 1987 и 1991 годах соответственно от пациентов в Камеруне». Они были классифицированы как подтип O ВИЧ-1. К 1994 году доказательства были представлены данные, которые «указывают на то, что подтип O является эндемичным в Камеруне и Габоне» (167)». Анализ последовательности ДНК MVP-5180 показал, что его генетическая организация аналогична ВИЧ-1, с 65% сходством с ВИЧ-1 и 56% сходством с консенсусными последовательностями ВИЧ-2. Ген env MVP-5180 имел сходство с ВИЧ-1 и ВИЧ-2 на 53 и 49% соответственно... Сравнение аминокислотной последовательности MVP-5180 с таковой из вируса шимпанзе Габона показало сходство в 70, 78 и 53% в генах gag, pol и env соответственно; Было обнаружено сходство 70, 76 и 51% с вирусом ВИЧ-1 в Уганде (U455) и 54, 57 и 34% с изолятом ВИЧ-2 D205 ". Исследователи из Германии и Камеруна, которые проводили это исследование, выразили мнение, что "Могут существовать даже более разные виды ВИЧ. Такие разные формы ВИЧ могут передаваться обычными путями (половым путем, через кровь и от матери ребенку), ведет к более широкому распространению. Они должны быть приняты во внимание при разработке вакцины и чувствительности и специфичности диагностических тестов ". (168) Действительно, похоже, что это так. В прошлом году Дэвид Хо и его коллеги (169) изучали австралийского пациента с" первичной инфекцией ". "." Поскольку сероконвертеры обычно содержат относительно однородную популяцию вирусов ", они были удивлены, когда обнаружили, что он был" коинфицирован "" множественным ВИЧ-1 подтипа B... Средние генетические дистанции между группами I и II., I и III, а также II и III составляли 9,6, 16,5 и 18,4% соответственно... Одна популяция последовательностей была четко отличима от других на основе филогенетического анализа. Кроме того,

То, что «ДНК ВИЧ» может быть «даже более дивергентной», чем принято считать, лучше всего иллюстрирует исследование, опубликованное в этом году исследователями из США. Поскольку ингибиторы протеазы становятся препаратами выбора для лечения «ВИЧ-инфицированных» людей, и поскольку «естественные мутации у пациентов, инфицированных ВИЧ-1, имеют важное значение для терапии и результатов клинических исследований», эти исследователи выполнили «последовательность действий» анализ гена pr [гена протеазы] в 167 штаммах вируса ВИЧ-1 от 102 пациентов, ранее не подвергавшихся ингибитору протеазы, собранных из различных географических регионов США». "Учитывая относительно небольшой размер фермента и ограничения в его структуре, налагаемые функцией, разумно было заключить, что вариабельность последовательностей ВИЧ-1 будет ограничена». К их удивлению было обнаружено, что«всего 41% нуклеотидов и 49,5% (49/99) аминокислот были вариабельными. Аминокислотное разнообразие, наблюдаемое в этих вирусных изолятах США, намного больше, чем то, о котором сообщалось ранее для вирусов ВИЧ-1 из клады B, а также больше, чем в генах pr для всех кладов ВИЧ-1 (40 из 99, 40% аминокислоты различаются»! (170) В настоящее время больше, чем в 1986 году, когда Галло и его коллеги пришли к выводу, что«скорость генетических изменений вируса СПИДа более чем в миллион раз выше, чем для большинства геномов ДНК, и даже может быть в десять раз больше, чем для некоторых других РНК-вирусов, включая некоторые ретровирусы и вирус гриппа A ", а в 1989 г. когда исследователи Пастера пришли к выводу, что «задача определения ВИЧ-инфекции в молекулярных терминах будет сложной», не было никаких доказательств, подтверждающих существование уникальной молекулярной сущности «РНК ВИЧ» («ДНК ВИЧ»). Фактически, существует ряд причин, по которым мириады несоизмеримых «ДНК ВИЧ» нельзя даже описать «в терминах популяций близкородственных геномов, называемых квазивидами». (153) К ним относятся: (a) Eigen и его коллеги разработали модель квазивидов для описания распределения самовоспроизводящихся РНК. Однако говорят, что «РНК ВИЧ» не является самореплицирующейся РНК, а реплицируется через промежуточное соединение ДНК; (б) самореплицирующаяся РНК вирусов РНК " демонстрируют замечательную стабильность в некоторых ситуациях. Вакцина против полиовируса Сабина 3-го типа отличалась от своего нейровирулентного предшественника только по 10 нуклеотидным положениям после 53 пассажей in vitro и 21 in vivo пассажей в тканях обезьяны. В 1977 году вирус гриппа A H1N1 вновь появился в человеческой популяции после 27 лет бездействия с последовательностями, в основном идентичными таковым вируса 1950-х годов». Хотя квазивидовая модель Эйгена использовалась для описания генома РНК-вирусов, даже 1% -ные различия в последовательностях в считается, что эти геномы представляют «крайнюю изменчивость». «Многие селективные силы могут стабилизировать вирусные популяции. Эти стабилизирующие факторы могут включать необходимость сохранения структуры и функции белка, вторичной структуры РНК, сайтов гликозилирования и сайтов фосфорилирования. Даже изменения третьего кодона могут подвергаться селективному давлению. Недавно наблюдалась замечательная консервация определенных последовательностей белковых доменов между совершенно неродственными РНК-вирусами. (171) Тогда можно описать «ДНК ВИЧ», даже если она имеет вариацию 10%, не говоря уже о 20, 30 или 40%. как это имеет место, как «популяция близкородственных геномов, именуемая квазивидами»?; (c) Определяя концепцию квазивида Эйген писал: «В устойчивом состоянии, которое в конечном итоге достигается, лучший конкурент, обозначенный главной последовательностью m, сосуществует со всеми мутантными последовательностями, полученными из него путем ошибочного копирования. Мы обозначаем это распределение последовательностей как квазивиды». Однако на сегодняшний день никто не доказал, что: (i) существует «ВИЧ» квазивиды, всегда находящиеся в равновесии; (ii) «близкородственные геномы ВИЧ» получены из основной последовательности; (iii) мастер-последовательность когда-либо существовала.

6.4.4 Если участок «РНК ВИЧ» является геномом экзогенного вируса, который инфицирует людей со СПИДом или лиц из группы риска, то эта РНК (или кДНК) должна присутствовать в свежей некультивированной ткани всех этих людей и ни у кого другого. Более того, если у этих людей наблюдается массивная ВИЧ-инфекция, как утверждают некоторые из наиболее известных экспертов по ВИЧ, (172,173) гибридизации по Саузерну должно быть более чем достаточно для ее обнаружения. Первое такое исследование было проведено Галло и его коллегами в 1984 году. Используя метод гибридизации по Саузерну, они протестировали многие ткани больных СПИДом, включая лимфатические узлы. Подводя итог своему открытию, они написали: «Ранее нам удавалось выделить HTLV-III из периферической крови или ткани лимфатических узлов большинства пациентов со СПИДом или ARC» (они «изолировали» это от примерно 50% пациентов, обращенных Галло). «Однако, как показано в данном документе, ДНК HTLV-III обычно не обнаруживается стандартной гибридизацией по Саузерн-блоттингу этих же тканей, и, когда это происходит, полосы часто становятся слабыми... увеличение лимфатических узлов, обычно обнаруживаемое у пациентов с ARC и СПИДом, не может быть непосредственно из-за пролиферации HTLV-III-инфицированных клеток... отсутствие выявляемых последовательностей HTLV-III в ткани саркомы Капоши пациентов со СПИДом предполагает, что эта опухоль не индуцируется напрямую инфицированием каждой опухолевой клетки HTLV-III.... наблюдение, что последовательности HTLV-III редко, если вообще обнаруживаются в мононуклеарных клетках периферической крови, костном мозге и селезенке, дает первое прямое свидетельство того, что эти ткани не инфицированы HTLV-III в значительной степени или широко при СПИДе или ARC». (96) Эти исследования были подтверждены многими другими исследователями. Обнаружение того, что при положительных результатах полосы гибридизации были «слабыми», «слабый сигнал» был интерпретирован как доказательство того, что ВИЧ-серопозитивные люди содержат ДНК ВИЧ в небольшом количестве клеток и с низким числом копий, интерпретация, которая стала общепринятой, хотя У Галло и его коллег было альтернативное объяснение: «Теоретически такую ​​низкую интенсивность сигнала можно также объяснить присутствием в этих клетках вируса, отдаленно гомологичного HTLV-III» (96). Это альтернативное объяснение игнорировалось всеми, включая Галло., Однако на встрече в Вашингтоне в 1994 г., спонсируемой Национальным институтом наркозависимости США, Галло признал: «Мы никогда не находили ДНК ВИЧ в опухолевых клетках KS... Блаттнер и Гелдерблом соглашаются, что гены pol и gag «могут быть высококонсервативными между подтипами вирусов» (см. 5.6). В статье, опубликованной в 1996 году Рейнхартом Куртом и его коллегами, говорится: «Ретротранспозоны эволюционировали в самых разных организмах, от простейших до человека. В этих элементах гены RT связаны с генами, которые кодируют полипротеины, способные к самоагрегированию. и для образования ядерных частиц. Эти белки являются эквивалентами ретровирусных капсидных белков, обычно называемых группоспецифическими антигенами (gag)... Они [ретротранспозоны] могут быть производными или предшественниками ретровирусов. Ретровирусы отличаются от ретротранспозонов наличием по крайней мере, одна дополнительная кодирующая область, ген оболочки (env)». (175) В 1984 году группа Галло сообщила, что«Геном ВИЧ «гибридизирован» со «структурными генами (gag, pol и env) как HTLV-I, так и HTLV-II. (56) Очевидно, обнаружение положительного«сигнала»гибридизации, по крайней мере, с gag«ВИЧ»или зонд pol не является доказательством существования «генома ВИЧ»; Фактически, в настоящее время также существуют доказательства, которые показывают присутствие последовательностей «ВИЧ» в неинфицированных тканях: (i) хотя больше не принято считать, что ВИЧ передается или присутствует у насекомых, в 1986 году исследователи из Института Пастера. обнаружили последовательности ДНК ВИЧ у мух цеце, черных жуков и муравьиных львов из Заира и Центральноафриканской Республики; (176) (ii) в 1985 году Вайс и его коллеги сообщили об изоляции, из митогенно стимулированных культур Т-клеток двух пациентов с общей вариабельной гипогаммаглобулинемией, ретровируса, который «явно был связан с HTLV-III / LAV»; Доказательства включали положительный ВБ с сывороткой от СПИДа и гибридизацию с зондами ВИЧ; (177) (iii) ДНК, выделенная из щитовидной железы пациентов с болезнью Грейвса, гибридизируется с «всей кодирующей областью gag p24» ВИЧ; (178) (iv) в исследование, направленное на решение вопроса, инфицированы ли нейронные клетки пациентов с комплексом СПИДа и деменции ВИЧ, «мозг 10 пациентов со СПИДом и неврологические доказательства вирусного энцефалита, а также мозг 5 пациентов без инфекции ВИЧ-1» были исследованы с использованием зонд на ВИЧ. «Антисмысловой рибозонд гибридизировался с клетками, о которых известно, что они инфицированы ВИЧ-1. Он гибридизировался с ВИЧ-1-инфицированными клетками A3.O1, а также с лимфоцитами селезенки и почек, полученными при вскрытии трупов больных СПИДом. Однако зонд не гибридизировался с нейронами в срезах мозга от 10 пациентов со СПИДом... Удивительно, когда мы применили контрольно-смысловой зонд с кляпом ВИЧ-1 к срезам мозга от пациентов со СПИДом, мы наблюдали специфическую гибридизацию с нейронами. клетки. Аналогичным образом, когда были исследованы срезы мозга пяти человек, не инфицированных ВИЧ-1, сенсорный зонд ВИЧ-1 обнаружил транскрипты в нейрональных клетках. Наш Нозерн-блот-анализ подтвердил эти результаты и продемонстрировал присутствие полиаденилированного транскрипта размером 9,0 т.п.н. в тканях мозга».179 Таким образом, либо положительные сигналы гибридизации, полученные с помощью антисмыслового зонда, не являются ВИЧ-специфическими, либо, как пришли авторы, существует нейрон-специфический транскрипт размером 9,0 т.п.н., который демонстрирует обширную гомологию с антисмысловыми последовательностями gag ВИЧ-1, и что этот транскрипт экспрессируется в нейрональных клетках как ВИЧ-1-инфицированных, так и неинфицированных индивидуумов; (V). Хоровиц и др. «Описывают первое сообщение о наличии нуклеотидных последовательностей, связанных с ВИЧ-1, в ДНК человека, шимпанзе и макаки-резуса от нормальных неинфицированных людей». Они «продемонстрировали присутствие сложного семейства последовательностей, связанных с ВИЧ-1» у вышеуказанных видов, и пришли к выводу, что «дальнейший анализ членов этого семейства поможет определить, вносят ли такие эндогенные последовательности вклад в эволюцию ВИЧ-1 посредством рекомбинации. события или эти элементы либо напрямую, либо через белковые продукты,

6.4.5 Во второй половине 1980-х годов, чтобы спасти концепцию «генома ВИЧ», специалисты по ВИЧ широко использовали недавно открытый процесс, известный как полимеразная цепная реакция (ПЦР). Хотя ПЦР - очень полезный инструмент в молекулярной биологии, существует много проблем, связанных с ее использованием при изучении «генома ВИЧ»: (а) ПЦР - чрезвычайно чувствительный метод. В описании своего открытия, получившего Нобелевскую премию, Кэри Маллис, который сам иронически скептически относился к гипотезе ВИЧ / СПИДа, написал: «Начиная с одной молекулы ПЦР может генерировать 100 миллиардов подобных молекул за полдень». (181) С такой амплификацией это не так. трудно обнаружить даже очень низкие уровни «генома ВИЧ». Однако «яркая особенность полученных результатов» к 1990 г. с помощью ПЦР, как и при стандартной гибридизации по Саузерну / Нозерну, выявился «дефицит или очевидное отсутствие вирусной ДНК у части пациентов». (182) В дальнейших усилиях по спасению «генома ВИЧ» в 1990-х годах исследователи из Департамент генетики Эдинбургского университета представил модифицированную версию ПЦР, метод двойной ПЦР или вложенной ПЦР. «Двойная ПЦР решает проблему ограниченной амплификации редких матричных последовательностей». Они сообщили, что «Используя двойную полимеразную цепную реакцию, которая позволяет обнаруживать одиночную молекулу провируса, и метод количественного определения молекул провируса, мы измерили частоту провирусов у инфицированных людей до уровня одной молекулы на 105 PBMC..Как общее правило, только небольшая часть PBMC содержит провирус (среднее значение образцов от 12 пациентов один на 8.000 клеток) "... образцы от 7 из наших 12 пациентов (60%) содержали один или несколько провирусов на 104 клеток... тогда как образцы от все (100%) наши пациенты содержали один или несколько провирусов на 80 000 клеток». Они пришли к выводу: «Самой поразительной особенностью результатов является чрезвычайно низкий уровень провируса ВИЧ, присутствующий в циркулирующих PBMC в большинстве случаев». (182) Нет сомнений в том, что ПЦР может «амплифицировать ДНК-иглу в ДНК-стог сена». «но даже ПЦР не может творить чудес.

обычно в ответ на инициирующие стимулы, вызванные инфекцией или воспалением». Кроме того,«многие эндогенные продукты вызывают высвобождение эндогенных пирогенов, тем самым вызывая лихорадку. Такие эндогенные вещества включают комплексы антиген-антитело, комплексы с комплементом, продукты расщепления комплемента, метаболиты стероидных гормонов, желчные кислоты и некоторые цитокины». (185) Поскольку«вирус [«ВИЧ»] реплицируется 24 часа в сутки и с первого дня», (155) и«2 × 109 CD4 + клеток [] продуцируются и разрушаются каждый день», а также лихорадка и«многие связанные с лихорадкой признаки могут быть воспроизведены инфузиями очищенных цитокинов, включая боль в спине, генерализованные миалгии, арталгии, анорексию. и сонливость», (185) действительно удивительно, что такие«массовые» инфекция и разрушение клеток могут оставаться в значительной степени, если не полностью, бессимптомными в течение длительных периодов времени у ВИЧ-инфицированных лиц; (ii) Если существует такая «массовая» ВИЧ-инфекция, почему она не обнаруживается стандартными процедурами гибридизации и почему для обнаружения такой «массовой» инфекции авторы не использовали ПЦР, которая может «амплифицировать ДНК-иглу». в ДНК-стог сена»или даже вложенную ПЦР, но были обязаны определить«Вирусную РНК»с помощью новых анализов,«модифицированной разветвленной ДНК (бДНК) или анализа RT-PCR и подтвержденной QC-PCR», для которой не приводятся подробности?

Одна из многих проблем (186 187), связанных с исследованиями Хо и Вэй и применяемыми в них методами, проиллюстрирована в презентации на XI Международной конференции по СПИДу. Исследователи из Медицинской школы в Камдене, штат Нью-Джерси, взяли один образец плазмы у пациента «с числом CD4-клеток 123 клеток / см» и разделили его на десять аликвот. РНК из каждого образца подвергали обратной транскрипции, и кДНК затем амплифицировали с ДНК внутреннего контроля (имитирующей) с использованием праймеров gag... кДНК также объединяли из начальных 10 индивидуальных реакций RT, и QC-PCR выполняли 10 раз на объединенных кДНК». Они сообщили, что «Среднее число копий ВИЧ-1 для 10 отдельных аликвот плазмы составляло 136 000 копий РНК / мл со стандартным отклонением 76 9 000 копий / мл (диапазон от 74 200 копий / мл до 334, 600 копий / мл). Среднее число копий ВИЧ-1 для объединенной кДНК, проанализированной 10 раз, составило 145 900 копий / мл со стандартным отклонением 61 900 копий / мл (диапазон от 84 500 копий / мл до 259 300 копий / мл)... RT не является источником вариабельность результатов QC-PCR на ВИЧ-1. Скорее всего, вариабельность связана с различиями в амплификации целевой матрицы и внутреннего контроля, используемых в анализе QC-PCR»(188).

По словам Мэддокса и Уэйна-Хобсона, и Хо, и Вэй, и их коллеги смогли прийти к своим поразительным выводам только после десяти лет исследований в области ВИЧ, потому что они объединились с математиками и потому что они смогли использовать «новые методы для анализа низких уровней вирус задействован "! (курсив наш). Парадоксально, что самая резкая критика этих исследований исходила от математиков, таких как Фрэнк Буянуцкас из Департамента математики и компьютерных наук Городского университета, Бронкс, штат Нью-Йорк, США и Марк Крэддок, Школа математики и статистики, Сиднейский университет., Австралия. «Что это за виремия миллиардов частиц РНК, которую можно увидеть только с помощью недокументированной ПЦР-ответвления или ПЦР, но не с помощью функционального теста на инфекционность?» (189) «Мой вопрос таков. Что именно нужно, чтобы получить люди, занимающиеся исследованиями в области ВИЧ, чтобы отвернуться от высоких технологий, непроверенных методов, загадочных спекуляций о молекулярных взаимодействиях и т.д. независимо от того, где находится такая уникальная ДНК. По мнению тех же исследователей, «из-за обширного генетического разнообразия ВИЧ-1 возможности идентифицировать одну пару праймеров, способную к амплификации различных подтипов, ограничены». (193,194) Фактически, результаты амплификации, полученные с праймерами для разных генов из один подтип не полностью согласен. Например, в первой ПЦР «ВИЧ» были использованы две пары праймеров для амплификации гена gag, и было обнаружено, что «некоторые образцы дали положительный результат только с одной из двух пар праймеров» (195). Люди из США и Европы почти исключительно инфицированы подтипом B. Однако исследователи из Эдинбургского университета обнаружили, что «результаты, полученные с использованием праймеров gag и env, не полностью совпадают. как уникальное молекулярное образование. В самом деле, если такая изменчивость принимается во внимание, то это может быть только отсутствие огромного разнообразия пар праймеров, которое не позволяет всем Homo sapiens «инфицироваться ВИЧ»; (iii) геном неисправен. (d) Никакая значимая информация не может быть получена из теста, если тест не стандартизирован и не доказана воспроизводимость. В настоящее время таких данных для ПЦР нет. Фактически, поскольку существует так много подтипов «ВИЧ» и нужно использовать разные праймеры для разных подтипов или даже для одного и того же подтипа, это делает крайне маловероятным получение таких данных. (e) Безусловно, наиболее важным параметром теста является его специфичность, то есть, как часто тест оказывается отрицательным, когда искомое условие отсутствует. Для ПЦР необходимо иметь доказательство того, что праймеры: (i) принадлежать к уникальному ретровирусу, как это определено в процедурах, описанных в 6.1; (ii) последовательности праймеров встречаются только в уникальном ретровирусе и больше нигде; Для праймеров «ВИЧ» таких доказательств не существует. Фактически, поскольку невозможно сказать, что представляют собой последовательности «ДНК ВИЧ», отсюда следует, что также невозможно указать, что представляют собой праймеры. Даже если предположить, что «ДНК ВИЧ» и, следовательно, праймеры специфичны для ретровируса, поскольку: (а) большинство праймеров «ВИЧ» происходит из лейкемических клеточных линий HUT78 (H9), CEM и клеток, трансформированных EBV; (b) есть доказательства того, что лейкемические клетки и клетки, трансформированные EBV, содержат эндогенные ретровирусы, включая линию клеток CEM; 88 (c) " высвобождение эндогенных ретровирусов можно вызвать методами, используемыми для «выделения ВИЧ»; (d) сам Галло сообщил, что клеточная линия HUT78 (H9) «содержит провирусные последовательности HTLV [-I]»; (105) (e) не существует метода отделения одного ретровируса от другого; невозможно сказать, что зонды «ДНК ВИЧ» являются ВИЧ, или зондами ДНК эндогенного ретровируса или даже экзогенного ретровируса HTLV-I; (iii) в образце ДНК (РНК) праймеры связываются только с последовательностями ВИЧ, а не с любыми другими последовательностями, не гомологичными или негомологичными ВИЧ. Опять же, таких данных нет. Кроме того, учитывая тот факт, что: (а) «около одного процента генома человека» состоит из эндогенных ретровирусных последовательностей; (б) гомологии существуют между генами эндогенных и экзогенных ретровирусов, особенно в генах gag и pol и между этими генами и клеточными ретроэлементами; специфическое связывание праймеров «ВИЧ» маловероятно.

Даже если (i) - (iii) доказаны, все равно необходимо определить специфичность реакции ПЦР, то есть показать, что у лиц, не инфицированных ВИЧ, положительных результатов не наблюдается. Это можно определить только путем выделения ВИЧ в качестве независимого золотого стандарта, то есть путем сравнения ПЦР с процедурами, перечисленными в (см. 6.1). Этого не было сделано - факт, признанный одним из самых известных исследователей ВИЧ / СПИДа Уильямом Блаттнером: «Одна из трудностей при анализе специфичности и чувствительности человеческих ретровирусов [включая ВИЧ] - это отсутствие окончательного«золотого стандарта»». (59) (f) В настоящее время некоторые доказательства, полученные без использования золотого стандарта, показывают, что процедура ПЦР неспецифична: (i) было только одно исследование, в котором воспроизводимость, Изучены чувствительность и специфичность ПЦР. В этом исследовании золотым стандартом был не выделение ВИЧ, а серологический (Вестерн-блоттинг) статус. В этом исследовании Кристин Дефер из Лаборатории инженерных наук, Регионального центра переливания крови, включая коллег из Института Пастера, изучала навыки тестирования ПЦР в «семи французских лабораториях с большим опытом обнаружения ДНК ВИЧ с помощью ПЦР». Были протестированы четыре группы людей: с «однозначными положительными результатами теста на ВИЧ» (ELISA подтвержден вестерн-блоттингом); «лица с низким риском заражения ВИЧ, у которых выявлено стойкое изолированное антитело против p24 при Вестерн-блоттинге»; «ВИЧ-1 серонегативные (по ИФА) лица с низким риском заражения ВИЧ (доноры крови)»,

В исследовании 327 медицинских работников, подвергшихся уколу иглой «вируса иммунодефицита человека», у 4 были «один или несколько положительных» тестов ПЦР. Еще 7 имели «неопределенный результат теста ПЦР на исходном образце». Более поздние образцы для всех 11 были отрицательными: «не было сероконверсии или развития антигенемии p24» и «все испытуемые остались здоровыми» (204, 205). Хотя доказательства такого появления у взрослых носят спорадический характер, о них гораздо чаще сообщают у детей. Однако ПЦР не используется для рутинной диагностики ВИЧ-инфекции у взрослых и редко, если вообще, повторяется. В отличие от взрослых, ПЦР очень часто используется у детей, потому что «диагноз ВИЧ» «осложняется сохранением пассивно приобретенных материнских антител». К 1995 году многочисленные исследования на детях (206-209) показали, что положительная ПЦР превращается в отрицательную. Один из самых последних отчетов был опубликован в 1995 году французскими исследователями. В шестилетней когорте из 188 «инфицированных» детей, которая была проанализирована ретроспективно, 12 (6,7%) «избавились от ВИЧ-инфекции». У каждого ребенка было по крайней мере два положительных результата ПЦР в двух разных точках времени в течение первого года, за которыми следовали многочисленные (до 7) отрицательные результаты ПЦР. Для ПЦР исследователи использовали пары праймеров для областей генов gag, pol и env; и тест считался положительным, «если были амплифицированы по крайней мере два гена». Комментируя свои результаты, авторы писали: «Три разные комнаты с отдельными кондиционерами были использованы для экстракции ДНК, приготовления ПЦР-буфера, амплификации и блоттинга. Ампликоны никогда не переносились в область, зарезервированную для неамплифицированных последовательностей. Таким образом, положительные результаты ПЦР маловероятны из-за контаминации... Тем не менее, поскольку наши анализы ПЦР проводятся на неманипулированных клетках, загрязнение культуры, приводящее к ложноположительным результатам ПЦР, невозможно... Поэтому мы считаем, что вероятность повторного заражения на последовательных образцов от одного и того же ребенка мало ". Авторы" не смогли найти никакой корреляции между нейтрализующими или антителозависимыми клеточными антителами, опосредующими цитотоксичность, и клиренсом ВИЧ ". Из 139 детей, рожденных от ВИЧ-положительных матерей, но" явно отрицательных ", "восемь были ПЦР-положительными один раз на один вирусный ген (pol), три были положительными дважды на pol,

Еще одна практическая проблема заключается в том, что использование ПЦР для определения возможной ретровирусной этиологии различных заболеваний человека может быть осложнено эндогенными ретровирусами. Даже если кДНК используются для шаблонов ПЦР, необходимо учитывать транскрипционную активность эндогенных последовательностей». (119) В статье, опубликованной в этом году, где он обсуждает лабораторную диагностику«ВИЧ-инфекции», Филип Мортимер написал:«Другие методы диагностики, например, существуют тесты на антиген p24 и амплификация провирусной ДНК и РНК, но эти нововведения в диагностике ВИЧ необходимо сопоставить с тестом на ВИЧ, и их следует отклонять, если они не удовлетворяют потребности, которую не выполняет тестирование на антитела»(211). По мнению исследователей из Лондонского университета "

ВЫВОД

Настоящие данные не доказывают существование уникального молекулярного объекта «ДНК ВИЧ», который составляет геном уникального ретровируса, приобретенного извне, ВИЧ. Нет никаких доказательств существования «квазивидов ВИЧ». Также невозможно сказать, что именно представляют собой различные «ДНК ВИЧ», зонды и праймеры, полученные из этих ДНК, и последовательности в клеточной ДНК, с которой они гибридизуются.

И производить частицы, содержащие обратную транскриптазу; Специфические антигены ВИЧ (Fisher et al., 1985; Levy et al., 1986) имеют диаметр 100 нм под электронным микроскопом (Fisher et al., 1985), как и ожидалось для ретровирусов».

7.1 Прежде чем подробно обсуждать цитируемые доказательства, во избежание недоразумений будет полезно определить некоторые термины, включая клонирование ДНК, трансфекцию и клонирование вируса, а также доказательства, которые должны быть представлены для подтверждения этих явлений:

Плазмида - свободно реплицирующиеся круговые хромосомные элементы, присутствующие в бактериях. Они дублируются независимо от основного хромосомного элемента и часто используются для «переноса» фрагмента ДНК в клетку.

Клонирование ДНК - получение идентичных копий фрагмента ДНК, любого фрагмента ДНК из фрагмента наследственной ДНК путем сплайсинга в подходящий носитель для клонирования, например, бактериофаг или плазмиду;

Трансфекция - введение экзогенной ДНК в клетки и ее способность реплицироваться и выражаться в этих клетках, то есть транскрипция ДНК в РНК, трансляция РНК в белки. Генетический материал не обязательно должен иметь вирусное происхождение, и трансфекция может быть достигнута различными методами. Еще в 1969 году было известно, что эти методы могут включать «инфицирование клеток бактериями и вирусами, образование гибридов двух типов клеток путем слияния, трансплантацию отдельных отдельных ядер в яйцах и эмбрионах, микроинъекции ядер и фракций митохондрий и т. Д. пиноцитарное поглощение очищенной ДНК». В том же году Маргит Насс из Пенсильванского университета, воспользовавшись «фагоцитарными свойствами мышиных фибробластов (L-клеток), выращенных в суспензионной культуре», продемонстрировала это». Фибробласты мыши (L-клетки) в суспензионной культуре включали изолированные хлоропласты шпината и африканских фиалок и изолированные митохондрии куриной печени... Зеленые клетки делились, как нормальные клетки. За зелеными хлоропластами наблюдали в течение пяти поколений клеток или 5 дней, при этом количество гибридных клеток значительно превосходило численность незеленых потомственных клеток». (214) К 1989 году стало понятно, что доставке ДНК в клетки могут способствовать поликатионные реагенты, такие как поли -DEAE декстрон и полиорнитин. «Аликвоту водного реагента просто добавляют в эксперимент по культуре ткани вместе с интересующей ДНК или РНК». (215) (Интересно, что культуры / сокультуры, полученные из тканей ВИЧ-положительных пациентов и больных СПИДом, обрабатывают поликатионным полибреном и / или окислителями, которые могут приводить к образованию катионов). В 1990 году исследователи из Университета Висконсина показали, что «инъекция чистой РНК или ДНК непосредственно в скелетные мышцы мышей приводит к значительной экспрессии репортерных генов в мышечных клетках... Векторы экспрессии РНК и ДНК, содержащие гены хлорамфениколацетилтрансферазы, люциферазы и β-галактозидазу вводили отдельно в скелетные мышцы мышей in vivo. Экспрессия белка была легко обнаружена во всех случаях, и для этих эффектов не требовалось специальной системы доставки.

Клонирование вируса - введение в клетки генетического материала, ДНК или РНК, которые, как было заранее доказано, являются геномом вируса, с последующим появлением в тех же клетках вирусов, идентичных во всех аспектах вирусам, из которых произошел геномный материал. Прежде чем можно будет заявить о доказательстве клонирования ретровируса, необходимо: (а) получить частицу (частицы), отделенные от всего остального (изолированные), и показать, что частица содержит, помимо других молекул, белки и нуклеино