Генная инженерия. Создание и использование рекомбинантных ДНК.

Генная инженерия - система экспериментальных приемов, позволяющих конструировать лабораторным путем (в пробирке) искусственные генетические структуры в виде так называемых рекомбинантных или гибридных молекул ДНК.

Технология рекомбинантных ДНК использует следующие методы:

1. Специфическое расщепление ДНК рестриктазами. В качестве мишеней рестриктаз часто выступают палиндромы из 4-6 пар оснований - сайты рестрикции. Одни рестриктазы вносят разрывы по оси симметрии, образуются так называемые "тупые" концы. Другие - со сдвигом, образуются "липкие" концы, то есть фрагменты имеют на своих концах однонитевые взаимно комплементарные участки длиной в четыре нуклеотида. Такие фрагменты особенно удобны для создания рекомбинантных ДНК.

2. Секвенирование нуклеотидов. С помощью электрофореза фрагменты ДНК, различающиеся по размеру, можно разделить, а затем исследовать каждый фрагмент отдельно. Это позволяет построить рестрикционную карту, на которой указано положение каждого сайта рестрикции относительно других участков.

3. Конструирование рекомбинантной ДНК:

Для получения рекомбинантной ДНК плазмиды выделяют из Е. coli и удаляют из них часть кольцевой молекулы ДНК с помощью рестриктазы. Комплементарные цепи молекулы ДНК разрезаются в разных местах, в результате чего образуются «липкие» концы. На фрагменте ДНК, выбранном для пересадки, создают «липкие» концы, используя ту же рестриктазу. Если смешать фрагмент ДНК (ген) и плазмиду, то они соединятся «липкими» концами. Затем с помощью лигазы вновь получают кольцевую молекулу ДНК, но теперь она вместе с плазмидной ДНК содержит ген, выбранный для пересадки. Это и есть рекомбинантная ДНК.

Возможны:

- сшивка по одноименным "липким" концам (рестриктазно лигазный метод). Комплементарные друг другу участки имеют тенденцию к ассоциации за счет спаривания оснований. Для восстановления разрывов используют фермент ДНК-лигазу.

- сшивка по "тупым" концам (коннекторный метод). Тупые концы могут быть соединены ДНК-лигазой. Эффективность реакции ниже, чем при сшивке по липким концам.

- сшивка фрагментов с разноименными липкими концами. Применяют линкеры - химически синтезированные олигонуклеотиды, представляющие собой сайты рестрикции или их комбинацию. Существуют линкеры "тупой конец - липкий конец".

Описанная выше процедура сложна и позволяет получать лишь очень небольшие количества рекомбинантной ДНК.

4. Клонирование (размножение) рекомбинантной ДНК:

- клонирование ДНК in vivo.

Если к культуре Е. coli добавить рекомбинантные плазмиды, то они могут включаться в бактериальные клетки - получаются рекомбинантные бактерии. Плазмиды в клетке начинают реплицироваться. При размножении бактерий вновь образующиеся бактериальные клетки тоже содержат эти плазмиды. Из рекомбинантных бактерий можно выделить клонированные рекомбинантные плазмиды, а из них - исследуемый фрагмент ДНК. Таким путем можно выделить ген или любой другой фрагмент ДНК в количествах, достаточных для исследовательских целей.

- аплификация (увеличение числа копий) ДНК in vitro.

В 1985 году К. Мюллис с сотрудниками разработали метод клонирования последовательностей ДНК in vitro, который получил название полимеразной цепной реакции (ПЦР). К анализируемому образцу ДНК добавляют в избытке 2 синтетических праймера. Праймеры ориентированы таким образом, что синтез с помощью полимеразы протекает только между ними, удваивая количество копий этого участка ДНК. Амплифицированный участок называют ампликоном. Амплификация заключается в повторяющихся циклах, представляющих собой трехступенчатый процесс: I - денатурация ДНК при 95 °С; II - отжиг праймеров с комплементарными последовательностями (40-60 °С); III - последующая достройка полинуклеотидных цепей от праймеров с помощью ДНК-полимеразы при температуре 70-75 °С (рис. 17).

Рис. 17. Амплификация ДНК in vitro

Продолжительность одного цикла менее 3 мин. Таким образом, за 2 ч можно получить около миллиарда копий определяемой последовательности ДНК. Размноженный in vitro фрагмент получают в количествах, достаточных для его прямого секвенирования. ПЦР называют бесклеточным молекулярным клонированием (cell-free molecular cloning).

С использованием ПЦР разработаны новые диагностические тесты на генетические и инфекционные заболевания. Метод используют для ранней диагностики наличия в организме вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). Метод анализа индивидуальных сперматозоидов нашел практическое применение в судебной медицине. С помощью ПЦР удалось амплифицировать и клонировать фрагменты митохондриальной ДНК из ископаемых останков мозга человека возраста 7 тысяч лет.

5. Введение гена в клетку. Ген нужно ввести в клетку таким образом, чтобы он не был разрушен клеточными нуклеазами, а интегрировался с геномом клетки. Используют 2 способа.

Трансдукция.

Вектор - молекула ДНК или РНК, состоящая из двух компонентов: векторной части (носителя) и клонируемого чужеродного гена. Задача вектора – донести выбранную ДНК в клетку-рецепиент и встроить ее в геном.

В состав вектора должен входить маркерный ген, позволяющий селектировать измененные клетки. Можно выделить 2 группы маркерных генов:

- селективные гены, отвечающие за устойчивость к антибиотикам или гербицидам;

- репортерные гены, кодирующие нейтральные для клеток белки, наличие которых в тканях может быть легко тестировано.

За способность гена к экспрессии отвечают регуляторные последовательности, которые также необходимо встроить в векторную молекулу.

Типы векторов:

- бактериальные плазмиды. Одна их наиболее часто употребляемых плазмид для клонирования pBR 322 создана на основе плазмид, выделенных из E. coli;

- вирусы. Есть вирусы, которые не ведут к гибели клетки, но встраиваются в геном клетки-хозяина и размножаются вместе с ней, либо вызывают ее неконтролируемый рост, т.е. превращают в раковую;

- гибридные векторы, содержащие ДНК фага и плазмиды - космиды и фазмиды.

2. Прямое введение гена в клетку – трансформация. Ее виды:

Трансфекция. ДНК адсорбируется на кристаллах фосфата кальция. Они поглощаются клеткой путем фагоцитоза.

Микроинъекция ДНК с помощью микропипеток диаметром 0,1-0,5 микрона и микроманипулятора.

Электропорация основана на том, что импульсы высокого напряжения обратимо увеличивают проницаемость биомембран.

«Мини-клетки» получают путем блокирования донорных клеток в митозе колцемидом. Вокруг каждой хромосомы формируется новая ядерная мембрана. Затем их обрабатывают цитохалазином В и центрифугируют. Образуются мини-клетки - микроядра, инкапсулированные в цитоплазматическую мембрану. Для их слияния подбирают специальные мягкие условия.

Упаковка в липосомы используется для защиты экзогенного генетического материала от разрушающего действия рестриктаз.

Метод биологической баллистики является одним из самых эффективных на сегодняшний день методов трансформации растений. На мельчайшие частички вольфрама напыляется ДНК вектора. Они помещаются внутрь биолистической пушки, откуда с огромной скоростью выбрасываются и, разрывая клеточные стенки, входят в цитоплазму и ядро клеток.

С развитием генной инженерии появилась возможность заставить микроорганизмы синтезировать вещества, которые получить другими методами сложно - интерферон, инсулин, соматостатин, соматотропин, фермент урокиназу, некоторые факторы свертывания крови и др. Все эти белки применяются для лечения болезней.

Плазмиды можно ввести и в клетки эукариот. Генетическая транформация соматических клеток млекопитающих позволяет изучать тонкие механизмы регуляции экспрессии генов и целенаправленно модифицировать генетический аппарат клетки, что имеет огромное значение для медицинской генетики.