Противовирусные свойства дсРНК

Важным явилось экспериментальное изучение интерферониндуцирующих и противовирусных свойств препаратов на основе РНК.

В предварительных экспериментах в Институте вирусологии им. Д.И.Ивановского было показано, что впРНК не обладает интерфероногеннными и противовирусными свойствами. Поэтому эти исследования целенаправленно проводились с дрожжевой дсРНК.

В таблице 5 представлены результаты характеризующие интерферониндуцирующую активность 5-ти разных партий препарата на основе дрожжевой дсРНК в зависимости от дозы при в\бр введении белым б\п мышам. Максимальные титры интерферона (853-1173 ИЕ\0,1 мл) в сыворотке крови наблюдаются при введении ридостина (вестина) в дозах 5-10 мг\кг. Но и в дозе 2,5 мг\кг ридостин способен вызывать значительную продукцию интерферона.

 

Таблица 5. Интерферониндуцирующая активность ридостина (вестина) при в/бр введении б/п мышам

 

Серия препарата	Титры интерферона (ИЕ50 /0,1 мл) в сыворотке при введении ридостина (вестина) в дозах (мг/кг)
	0,07	2,5
	30 ± 3	586 ± 39	1109 ± 73	1173 ± 173
	<20	512 ± 78	960 ± 143	960 ± 143
	<20	480 ± 72	853 ± 135	853 ± 135
	<20	576 ± 64	1024 ± 156	960 ± 156
	<20	384 ± 57	853 ± 135	960 ± 156

 

Как видно из рисунка 5, индуктор интерферона на основе дсРНК киллерных дрожжей относится к индукторам раннего типа, т.е. продукция интерферона (или интерферонов) происходит сразу же после введения. Максимум продукции зависит от способа введения: при в\в - через 0,5-2 часа, при в\бр и в\м - через 4-6 часов. К 24 часам сывороточный интерферон практически исчезает в организме мышей.

Подобная динамика интерфероногенеза наблюдается и у кроликов. Однако дозы, вызывающие такой ответ, в 2,5 раза ниже чем для мышей - кролик относится к высокореагирующим животным.

Другая динамика ответа на введение дрожжевой дсРНК наблюдается у поросят. Эти результаты получены нами совместно с Лабораторией болезней свиней д.в.н. С.И.Прудниковым (Рис. 6). Синтез интерферона или интерферонов у поросят имеет 2 пика: через 6 и 12 часов. Максимальный ответ после 1-ого введения индуктора интерферона в дозе 0,5 мг\кг развивается к 12 часам. Интерферон регистрируется в крови поросят в течение 3 суток. После 2-го введения на протяжении 3 суток следует фаза рефрактерности или гипореактивности, "молчания" генов, ответственных за синтез интерферона. Последующее введение дрожжевой дсРНК (вестина) поросятам в той же дозе индуцирует синтез интерферона с характерным 2-х пиковым профилем. У контрольных животных синтеза интерферона после введения физиологического раствора не наблюдается (нижняя часть рисунка 6).

 

 

Рис. 5. Динамика накопления интерферона в сыворотке крови мышей при разных путях введения индуктора интерферона на основе дсРНК (Вестин).

 

 

 

Рис. 6. Динамика накопления интерферона в сыворотке крови поросят при введении индуктора интерферона на основе дсРНК (Вестин).

 

Как у лабораторных животных, так и у продуктивных (свиней) в этом случае наблюдается развитие температурных реакций, фагоцитоза нейтрофилов и макрофаговЭти данные следует учитывать при разработке и проведении противоэпизоотических мероприятий.

В таблице 2, представленной ранее, были приведены данные о летальных дозах дсРНК, но дана только область значений. Это было сделано потому, что получить строгие значения летальных доз для индуктора интерферона очень трудно, поскольку в изучаемых нами образцах препаратов наблюдалось разное содержание дсРНК. Анализ связи (по величинам коэффициентов корреляции) между составом препаратов по количеству дсРНК, токсичностью и интерферониндуцирующей активностью (Табл. 6) показал, что между содержанием дсРНК и величиной среднесмертельных имеется тесная отрицательная корреляция, а с величиной интерферониндуцирующей активности - положительная.

Таблица 6. Коэффициенты корреляции между составом препарата дсРНК S.cerevisae, его интерфероногенной активностью и токсичностью

Показатели	Аиф	ЛД50	дсРНК, %	НМ, %	Белок, %
Аиф
ЛД50	- 0,404
дсРНК, %	+0,801	-0,739
НМ, %	-0,138	+0,348	-0,349
Белок, %	-0,343	-0,173	-0,302	-0,856

На рис. 7 представлена динамика интерферониндуцирующей активности в зависимости от дозы препарата (абсолютная активность) (кривая 1) и содержания в ней дсРНК (кривая 2). Эти результаты подтверждают полученные выше корреляции. Такой прием позволяет определить минимальную эффективную интерферониндуцирующую дозу дсРНК у мышей.

Рис. 7. Зависимость абсолютной (1) и удельной (2) интерферониндуцирующей активности дсРНК киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae у мышей от дозы препарата.

Величина её составила для дрожжевой дсРНК 1,71±0,20 мг\кг, а содержание в ней "чистой" дсРНК 0,41±0,057 мг\кг веса животных. Эти данные могут быть использованы для расчета ХТИ (химиотерапевтического индекса), являющегося важным показателем терапевтической активности противовирусных препаратов, к которым также можно отнести дрожжевую дсРНК.

Противовирусные исследования были проведены как на лабораторных, так и на других видах животных. На рис. 8 представлены результаты экспериментального изучения противовирусной активности ридостина (вестина) у различных классов животных.

 

 

Рис. 8. Противовирусная эффективность (% защиты по сравнению с контрольными животными) препарата Вестин.

 

Препарат обладает чрезвычайно широким спектром противовирусных эффектов на различных семействах вирусов, определенных in vivo как у лабораторных, так и сельскохозяйственных и домашних животных. Как видно из представленной схемы, эффективность его действия значительно колеблется. Это связано, в первую очередь, по-видимому, с отработкой схемы применения. Там, где эта схема подобрана, противовирусная эффективность препарата достигает высоких величин. Хотя нельзя отвергать и то обстоятельство, что это может являться отражением чувствительности и устойчивости определенных семейств вирусов к интерферонам. Эти данные свидетельствуют о том, что для такого противовирусного эффективного средства, каким является препарат Вестин (Ридостин), требуется тщательное изучение условий заболевания, подбора доз и особенностей инфекционного процесса.

Особенности применения препарата у высших и низших позвоночных изучались нами на поросятах, собаках и карпе при различных видах инфекционной патологии, которая на практике в большинстве случаев носит ассоциативный характер.

Как уже отмечалось выше (Рис. 6), при изучении процесса интерфероногенеза у животных (поросят) очень важен учет периода рефрактерности, т.е. гипореактивности или "молчания" генов. По результатам исследований оптимальная терапевтическая доза у поросят составила 0,5 мг\кг. Эффективность препарата была подтверждена д.в.н. С.И.Прудниковым с сотрудниками в производственных опытах на свинокомплексах "Шарапский" и "Кудряшовский". Эти результаты вошли в текст Инструкций по применению препаратов Полирибонат и Вестин для профилактики и лечения ассоциативных инфекций у поросят.

Особенности эффективного применения препарата вестин при вирусных заболеваниях собак чумой и парвовирусным энтеритом представлены в табл. 7.

 

Таблица 7. Результаты изучения эффективности препарата вестин при вирусных заболеваниях у собак

Форма заболевания	Кол-во заболев-ших животных	Доза, мг/кг	Кол-во инъек- ций	Выздоров- ление (гол)	Гибель (гол)	Эффектив- ность лечения, %
Чума плотоядных из них:		0,72
Кишечная форма		0,44	3-4		-
Кишечно-легочная		0,70	3-4		-
Легочная форма		0,93	2-3
Парвовирус-ный энтерит		1,3

 

 

Эти работы выполнялись совместно с сотрудниками Лаб. Фармакологии Факультета ветеринарной медицины НГАУ под рук. д.в.н. Г.А.Ноздрина. При различных формах чумы плотоядных эффективность препарата колеблется от 80 до 100%. При парвовирусном энтерите, очень быстро протекающей вирусной инфекции, эффективность составила 84%. Впервые нами продемонстрирована лечебная противовирусная активность вестина против чумы и парвовирусного энтерита. Отмечено также, что при введении препарата в вечернее время заболевание протекало в более легкой форме. Таким образом, введение препарата вестин (ридостин) в схему лечения собак с диагнозом чумы плотоядных и парвовирусного энтерита повышает терапевтическую эффективность до 95 и 84% соответственно и сокращает продолжительность лечения. При этом препарат выступает в роли этиотропного (специфического для данного заболевания и непосредственно направленного на подавление вируса) средства.

Во всех исследованиях на моделях бактериальных и вирусных заболеваний сельскохозяйственных животных мы отмечали очень высокую фагоцитоз стимулирующую реакцию на введение препаратов на основе вп- и дсРНК. Но в случае с дсРНК эта реакция носила преимущественно макрофаг стимулирующий характер. На рис. 9 представлены данные по стимуляции фагоцитоза перитонеальных макрофагов мышей под действием различных доз дсРНК. В качестве объекта фагоцитоза использовали эритроциты барана (ЭБ).

Вестин (ридостин) значительно стимулирует ФА (количество активированных макрофагов) через 5 часов после инъекции и незначительно ФИ (количество поглощенных ЭБ на один макрофаг). Оптимальная доза (как показывает график) составляет 25 – 50 мкг/мл (в пересчете на мышь - 5 мг\кг). Эти данные чрезвычайно важны для понимания механизма противовирусного и иммуномодулирующего действия препаратов РНК. Известны экспериментальные данные о том, что эффекты стимуляции макрофагов связаны с синтезом g-интерферона в организме. Именно g-интерферон запускает активность макрофагов, которые в дальнейшем синтезируют ряд цитокинов и лимфокинов, т.е. цитокиновую "сеть" организма.

 

 

Рис. 9. Оценка фагоцитоз-стимулирующей активности макрофагов под действием дсРНК ридостина (вестина) и его субстанции.