Типы сред и способы культивирования микроорганизмов

Разнообразные питательные среды, используемые в микробиологической практике для культивирования микроорганизмов, подразделяются по составу, физическому состоянию и назначению.

По составу среды делятся на натуральные и синтетические. Синтетические среды применяют для изучения обмена веществ у микроорганизмов. Они имеют определенный химический состав с точным указанием концентрации каждого соединения. Натуральные среды применяют для накопления биомассы микроорганизмов и широко используют для первичного выделения из естественных субстратов, поскольку их состав позволяет удовлетворить питательные потребности многих групп микроорганизмов. В них содержатся богатые различными органическими веществами продукты животного или растительного происхождения, имеющие сложный и непостоянный состав. Часто натуральные среды готовят на основе мясо-пептонного бульона (МПБ) и солодового сусла. МПБ – это прокипяченный экстракт мясного фарша с добавлением пептона и поваренной соли. Он богат азотсодержащими органическими соединениями, но обеднен углеводами. Солодовое сусло, напротив, содержит преимущественно углеводы. Его получают путем настаивания размолотого солода в водопроводной воде при постепенном нагревании. Солодом называют пророщенные и высушенные зерна ячменя. В процессе приготовления сусла происходит гидролиз крахмала ячменя и экстракция сахаров в воду. В зависимости от партии зерна концентрация сахаров в сусле может быть разной. Ее выражают в градусах Баллинга (^оБ), что примерно соответствуют процентному содержанию сахаров в растворе. Сусло с разной концентрацией сахаров применяют для выращивания разных групп микроорганизмов.

Жидкие среды представляют собой растворы или суспензии ингредиентов в воде. В качестве сыпучих сред применяют наборы длительно хранящихся сухих компонентов, которые перед работой растворяют или смачивают водой. Это могут быть зерно, отруби, твердые отходы сельского хозяйства и пищевой промышленности. В настоящее время получили широкое распространение порошкообразные синтетические и натуральные среды. Для получения твердых сред в жидкую основу добавляют уплотняющие агенты. Наиболее известными отвердителями являются желатин, агар и силикагель. Желатин – это белок из соединительной ткани животных, образующий гель при 25^оС. Неудобство его применения заключается в том, что температура роста многих микроорганизмов выше, чем температура плавления желатина. Наличие протеолитических ферментов у многих микроорганизмов приводит к расщеплению и разжижению желатина. Более удобен как уплотнитель сложный полисахарид агар, получаемый из морских бурых водорослей, так как большинство микроорганизмов не использует его для питания. Агар может многократно плавиться при 100^оС и застывать при 45^оС. Добавлением 2% агара в жидкую основу получают широко применяемые мясо-пептонный агар (МПА), сусло-агар (СА) и бульон-сусло-агар (БСА). В качестве твердой основы для синтетических сред часто используют неорганическое соединение кремния силикагель.

По назначению среды подразделяются на универсальные, элективные и индикаторные.

Универсальные среды используют для накопления микробных клеток и первоначального выявления видового разнообразия микроорганизмов в смешанных популяциях. Они позволяют поддерживать рост значительного числа микроорганизмов. В то же время следует помнить, что не существует одной среды, универсальной для всех микробных культур.

Элективные среды используют для получения накопительных культур как первого этапа при выделении чистой культуры из природных местообитаний. Создание условий, благоприятных для определенной группы микроорганизмов (элективных условий), приводит к преобладанию в смешанной популяции желаемых микроорганизмов. Рост и размножение других микроорганизмов в этих условиях незначительны.

Для быстрого выявления определенных групп микроорганизмов или особенностей их метаболизма применяют индикаторные среды, содержащие вещество-индикатор, реагирующий изменением цвета на проявление какого-либо свойства организма. Индикаторные среды наиболее часто используют в санитарной и медицинской микробиологии.

 

История генной инженерии

Важной составной частью биотехнологии является генетическая инженерия. Родившись в начале 70-х годов, она добилась сегодня больших успехов. Методы генной инженерии преобразуют клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих в "фабрики" для масштабного производства любого белка. Это дает возможность детально анализировать структуру и функции белков и использовать их в качестве лекарственных средств.

Генная инженерия - направление исследований в молекулярной биологии и генетике, конечной целью которых является получение с помощью лабораторных приемов организмов с новыми, в том числе и не встречающимися в природе, комбинациями наследственных свойств. В основе генной инженерии лежит обусловленная последними достижениями молекулярной биологии и генетики возможность целенаправленного манипулирования с фрагментами нуклеиновых кислот. К этим достижениям следует отнести установление универсальности генетического кода, то есть факта, что у всех живых организмов включение одних и тех же аминокислот в белковую молекулу кодируется одними и теми же последовательностями нуклеотидов в цепи ДНК; успехи генетической энзимологии, предоставившей в распоряжение исследователя набор ферментов, позволяющих получить в изолированном виде отдельные гены или фрагменты нуклеиновой кислоты, осуществлять in vitro синтез фрагментов нуклеиновых кислот, объединить в единое целое полученные фрагменты. Таким образом, изменение наследственных свойств организма с помощью генной инженерии сводится к конструированию из различных фрагментов нового генетического материала, введение этого материала в реципиентный организм, создания условий для его функционирования и стабильного наследования.

Генетическая инженерия не является наукой в широком смысле, но является инструментом биотехнологии, используя методы таких биологических наук, как молекулярная и клеточная биология, цитология, генетика, микробиология, вирусология.

Историю развития генетической инженерии можно условно разделить на три этапа.

Первый этап связан с доказательством принципиальной возможности получения рекомбинантных молекул ДНК in vitro. Эти работы касаются получения гибридов между различными плазмидами. Была доказана возможность создания рекомбинантных молекул с использованием исходных молекул ДНК из различных видов и штаммов бактерий, их жизнеспособность, стабильность и функционирование.

Второй этап связан с началом работ по получению рекомбинантных молекул ДНК между хромосомными генами прокариот и различными плазмидами, доказательством их стабильности и жизнеспособности.

Третий этап - начало работ по включению в векторные молекулы ДНК (ДНК, используемые для переноса генов и способные встраиваться в генетический аппарат клетки-рецепиента) генов эукариот, главным образом, животных.

Генная инженерия появилась благодаря работам многих исследователей в разных отраслях биохимии и молекулярной генетики. На протяжении многих лет главным классом макромолекул считали белки. Существовало даже предположение, что гены имеют белковую природу. Лишь в 1944 году Эйвери, Мак Леод и Мак Карти показали, что носителем наследственной информации является ДНК. С этого времени начинается интенсивное изучение нуклеиновых кислот. Спустя десятилетие, в 1953 году Дж. Уотсон и Ф. Крик создали двуспиральную модель ДНК. Именно этот год принято считать годом рождения молекулярной биологии.

Формально датой рождения генетической инженерии следует считать 1972 год, когда в Стенфордском университете П. Берг, С. Коэн, Х. Бойер с сотрудниками создали первую рекомбинантную ДНК, содержавшую фрагменты ДНК вируса SV40, бактериофага и E. coli.

На рубеже 50 - 60-х годов были выяснены свойства генетического кода, а к концу 60-х годов его универсальность была подтверждена экспериментально. Шло интенсивное развитие молекулярной генетики, объектами которой стали E. coli, ее вирусы и плазмиды. Были разработаны методы выделения высокоочищенных препаратов неповрежденных молекул ДНК, плазмид и вирусов. ДНК вирусов и плазмид вводили в клетки в биологически активной форме, обеспечивая ее репликацию и экспрессию соответствующих генов. В 70-х годах был открыт ряд ферментов, катализирующих реакции превращения ДНК. Особая роль в развитии методов генной инженерии принадлежит рестриктазам и ДНК-лигазам.

 

Задачи генной инженерии:

создание рекомбинантных ДНК, которые состоят из фрагментов молекул ДНК, полученных от разных организмов

Рекомбинантные ДНК создаются для определенных научных целей

 

Принципы генной инженерии:

ü Конструирование рекомбинантных молекул ДНК

ü Перенос ДНК в клетки-реципиенты

ü Селекция и отбор трансформированных клеток

ü Клонирование рекомбинантной ДНК в клетках хозяина

Методы генной инженерии

Метод рекомбинантных ДНК для многих специалистов является краеугольным камнем здания биотехнологии. Создание рекомбинантной ДНК буквально означает объединение (рекомбинирование) двух отрезков ДНК разных видов. Успех технологии рекомбинантных ДНК (рДНК) принесло использование бактериальных ферментов, таких как:

• рестрикционные эндонуклеазы (рестриктазы), которые разрезают молекулы ДНК в определенных местах;

• ДНК-лигазы, которые соединяют концы молекул ДНК;

• ДНК-полимеразы, которые участвуют в репликации ДНК.

Каким бы ни было применение этой технологии, конечным итогом процедуры всегда является стабильная и наследуемая экспрессия какого-либо нового признака. Применяется рДНК для модификации различных организмов, но основные этапы работы схожи.

 

Строение ДНК/рДНК

Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) — один из двух типов нуклеиновых кислот, обеспечивающих хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов. Собственно хранение наследственной информации в ДНК и синтез РНК – это основные функции ядра клетки.

ДНК организма содержит в себе всю генетическую информацию организма, называемую геномом. Геном же представляет собой совокупность всех генов организма, каждый из которых отвечает за развитие определенного признака или свойства организма. Геном – вещь отнюдь не простая для расшифровки и понимания. Так, например, геном человека состоит примерно из 20 000 генов и каждый из них несет в себе какую-то генетическую информацию.

Интерес к ДНК как носителю генетической информации резко возрос к началу 50-х годов, и структура ДНК была вскоре установлена. ДНК собрана из нуклеотидов, каждый из которых имеет фосфатную группу, связанную ковалентно с пяти-углеродным сахаром. Каждый такой сахар связан с одним из четырех азотистых оснований. История открытия структуры ДНК описана американским биохимиком Джеймсом Уотсоном в его книге «Двойная спираль» (1968 г). В Кембридже Уотсон познакомился с Криком, физиком, который переквалифицировался в биохимика. Из общения с химиками Уотсон узнал, что структурные формулы, которыми они пользовались, далеки от совершенства. Разобравшись в структуре пуринов (А, Г) и пиримидинов (Т, Ц), Уотсон и Крик решили, что они должны быть тесно связаны между собой. Если это так, то ДНК должна состоять из двух цепей. Цепи должны закручиваться между собой так, чтобы сохранялись определенные углы между группами атомов. Так возникла двойная спираль, в которой пурины и пиримидины выстроены по типу ступенек лестницы: роль "перекладин" играют основания, "веревок" - сахарофосфатные остовы. Каждая перекладинка образована из двух оснований, присоединенных к двум противоположным цепям, причем у одного из оснований одно кольцо, у другого - два. Следовательно, это может быть А и Т или Г и Ц. Поскольку в каждой паре есть одно основание с одним кольцом и одно - с двумя, величина перекладин одинаковая, и остовы цепей находятся на одном расстоянии. Две цепи удерживаются вместе водородными связями между основаниями. Статья Уотсона и Крика, в которой сообщалось о расшифровке структуры ДНК, заняла всего две странички в научном журнале, но она открыла новую эпоху в раскрытии тайны жизни. В первой же публикации (1953 г) Крик и Уотсон отметили, что такая структура хорошо объясняет и процесс "воспроизводства" этой молекулы. При рассоединении цепей возможно присоединение новых нуклеотидов к каждой из них, тогда около каждой старой возникнет новая цепь, точно ей соответствующая. Так впервые пришли к структуре, которая была способна к самовоспроизведению. Физики Крик и Уилкинс вместе с биохимиком Уотсоном стали лауреатами Нобелевской премии по физиологии и медицине за 1962 год.