Лекция 11. Спонтанный и индуцированный мутагенез. Физические факторы мутагенеза. Химический мутагенез. Биологические факторы мутагенеза.

МУТАГЕНЕЗ - процессы-реакции в генном аппарате биологического объекта, при которых происходят изменения в строении генов, передающиеся по наследству. Такие изменения могут затрагивать отдельные нуклеотиды или группы их, сопровождаясь в некоторых случаях изменениями в морфологии хромосом. Изменения уже одного нуклеотида, входящего в состав триплета, приводят к образованию иной аминокислоты, входящей в состав белка, и могут привести к изменению соответствующего признака.

Мутагенез можно условно делить на спонтанный, когда мутации возникают в "нормальных" условиях роста, и индуцированный вследствие применения физических или химических мутагенов. При спонтанном мутагенезе могут происходить все типы наследственных перемен, которые наблюдаются при индуцированном мутагенезе: замена пар аденин-тимин или чаще гуанин-цитозин, ошибочное спаривание двух пуринов или двух пиримидинов, делеции, включения и другие изменения. Каждый биологический объект характеризуется определенным фоном спонтанных мутаций, которые с разной частотой затрагивают те или иные генетические признаки. При этом одни виды обладают большей мутабельностыо, чем другие. Частота мутаций на ген на поколение у дрозофилы варьирует в обычных условиях от 10^-5 до 10^-6.

Частота спонтанных мутаций различных генов человека составляет 10^-5-10^-3 на ген на поколение. В связи с тем, что у человека примерно 2,5•10⁴ генов, общая частота его мутаций определяется 1 на каждого индивидуума в каждом поколении, то есть У каждого человека есть один мутировавший ген, которого не было у его родителей.

Долгое время объясняли спонтанный мутагенез действием космических лучей и естественного радиоактивного фона. Однако при экспериментальной проверке и проведении соответствующих вычислений, исходя из спонтанной мутабильности дрозофилы, было определено, что только 1/500-1/1200 доля всех спонтанных мутаций может происходить в результате действия доз радиации. Полагают, что одной из причин спонтанных изменений являются локальные флюктуации теплового движения атомов. Зависимость частоты спонтанных мутаций от времени подчиняется экспоненциальному закону, то есть логарифм приращения доли изменившихся особей пропорционален времени. Действительно, при старении клеток в них накапливаются мутационные изменения. Таким образом, спонтанный мутационный процесс характерен для каждого биологического объекта, а возникающие мутации являются материалов для естественного отбора.

Основные положения современной мутационной теории следующие.

1. Возникновение всякого наследственного изменения скачкообразно.

2. Изменения характеризуются "размахом" скачка, при этом резкие скачки улавливаются чаще, чем мелкие, которые бывают более многочисленными.

3. Мутационный процесс не направлен, то есть все признаки могут быть изменяемы, причем каждый признак может быть изменен в разных направлениях, но не в любых, так как структура признака эволюционно закреплена.

4. Мутации могут возникать на всех стадиях развития.

5. Мутации возникают как в половых, так и в соматических клетках.

6. Темп мутаций может быть различен, причем:

а) различные гены у одного вида мутируют с разной частотой, б) сходные гены в разных генотипах мутируют с различной скоростью, в) одни виды обладают более высокой мутационной изменчивостью, чем другие, что зависит от генотипического строения, степени адаптации к внешней среде и т. д.

7. Мутантные гены сохраняют свойства репродукции, вследствие чего мутационные изменения наследуются.

8. Каждый ген может мутировать в несколько состояний, образуя серию множественных аллелей.

9. Спонтанный мутационный процесс обусловливается свойством самого гена, системой генотипа, физиологическим состоянием организма и колебанием факторов внешней среды.

10. Мутации у различных видов организмов образуют гомологические ряды наследственных изменений, то есть у родственных видов, имеющих общее происхождение, возникают и сходные мутации (закон гомологических рядов; Н. И. Вавилов, 1935).

Изучение индуцированного мутагенеза включает различные направления, имеющие общебиологическое или прикладное значение. Центральное место занимает проблема управления процессами наследственности. Это направление включает исследования специфичности действия мутагенов, влияния на мутагенез различных процессов, протекающих в клетке, места в наследственных структурах и времени возникновения мутаций.

Мутагены используют в селекции микроорганизмов, растений и животных для получения полезных форм. Так, общее число антибиотиков, промышленный биосинтез которых стал возможным благодаря мутагенам, приближается к 300. Более 500 вариантов растений (пшеница, горох, кукуруза и др.), полученных методами мутагенеза, перспективны для селекции.

Если учесть, что у людей только часть спонтанных мутаций вызывается "естественной" радиацией, то остальные являются следствием воздействия химических мутагенов. Действительно, близкий Контакт человека с химическими веществами, широкое употребление химических, в частности лекарственных, веществ, многие из которых оказались мутагенами, являются содержанием следующего направления исследований мутагенеза. Канцерогенная активность некоторых мутагенов с избирательной локализацией опухолей у экспериментальных животных также составляет самостоятельный аспект индуцированного мутагенеза. Этот аспект неразрывно связан с канцеролитическим действием, нашедшим широкое применение в лечебной практике с физическими мутагенными агентами, а в последнее время апробируется со многими химическими соединениями.

Для уничтожения вредных насекомых были также применены методы индуцированного мутагенеза. Так, специально размноженные насекомые при обработке химическими мутагенами теряют способность к размножению и при скрещивании с нормальными насекомыми не оставляют потомства. Такие "стерилизованные" насекомые способны сократить плодовитость природных популяций на 95-99%. Таким путем в США была решена проблема уничтожения мухи каллитроги, вызывающей миаз мелкого рогатого скота, от которого погибало множество животных. В течение 6 месяцев еженедельно на каждую квадратную милю выпускали 400 стерилизованных насекомых, через 3 месяца (срок жизни трех поколений) каллитрога была истреблена полностью.

В самом начале изучения химического мутагенеза в опытах на дрозофиле было установлено, что мутационные изменения реализуются не сразу. Это выражалось в том, что при обработке мутагенами мутации часто возникали не в самих спермиях, а позднее - на разных стадиях развития личинки. В связи с этим были выделены предмутантная стадия, мутация гена и мутация клетки. На каждом этапе определенная роль в реализации наследственного изменения отводится температуре, облучению видимым светом, метаболитам и антиметаболитам и другим факторам, которые могут усиливать или ослаблять мутационный эффект. На протяжении всего мутационного процесса проявляется определенная специфичность действия мутагенов, зависящая от многих факторов. На этапе проникновения мутагена в клетку он реагирует со многими молекулами, вследствие чего активность мутагена может частично теряться. Поэтому многие мутагены, примененные и одних и тех же концентрация,х по-разному эффективны из-за неодинаковой концентрации, в которой они в конечном итоге достигают наследственного материала разных объектов. Другая альтернатива мутагена на пути к наследственному материалу - образование производного, более специфического, чем исходный мутаген (например, превращение азотистого иприта в формальдегид). Кроме того, химическое вещество может вообще быть слабым мутагеном, но благодаря действию на какой-либо фермент блокирование его вызывает скопление мутагенных продуктов (например, цианистый калий блокирует каталазу, которая в обычных условиях разлагает перекиси, обладающие мутагенным действием).

Определенную роль в реакции с мутагенами играют белки, что сказывается при сравнении эффекта действия на чистые нуклеиновые кислоты и целый вирус. Так, при действии азотистой кислоты на РНК вируса табачной мозаики дезаминируются аденин, цитозин и гуанин. В целом вирусе, когда РНК связана с белком, дезаминируются только аденин и цитозин. Взаимодействие мутагена и нуклеиновых кислот часто требует стабилизации, для которой в одних случаях необходима репликация, в других - время для перехода метастабильного состояния в стабильное, в-третьих - синтез белка. Относительно участия в процессе мутаций обеих или одной нити ДНК существуют две гипотезы. Согласно одной мутация затрагивает одну нить ДНК, которая впоследствии дает начало мутантным формам; другая нить дает начало нормальной дочерней ДНК и впоследствии обычной форме. Авторы второй гипотезы считают, что происходит одновременное возникновение мутаций в двух нитях ДНК благодаря участию репарационных ферментов.

Индуцированный мутагенез - процесс, имеющий определенную специфичность, которая зависит как от свойств мутагенов, так и особенностей генотипов биологических объектов. Уже первые работы по индуцированному мутагенезу привели исследователей к равнозначным представлениям об универсальности действия одних мутагенов и ограниченности действия других. Иприт и его производные вызывали мутации у всех испытуемых организмов, в то время как перекись водорода и диазометан были способны индуцировать мутации у насекомых и микроорганизмов, но не у растений. Уретан, фенолы и нитрозоамины мутагенны для растений, но не индуцируют мутации у нейроспоры. Формальдегид индуцирует мутации только у самцов на ранних стадиях сперматогенеза и не мутагенен для самок. Естественно, что специфичность действия мутагенов определяется химическими особенностями реакций с генным материалом. Предполагают, что повышенная мутабельность отдельных локусов может зависеть от большего скопления одних или других азотистых оснований, с которыми данный мутаген наиболее реактогенен. Вместе с тем повторяемость азотистых оснований в цепи нуклеиновых кислот объясняет причину изменчивости под действием мутагенов разных генов.

Различают следующие формы специфичности в зависимости от разрешающей точности применяемых методов.

1. Региональная специфичность, определяемая на хромосомном уровне, заключается в выявлении районов, где наиболее часто происходят разрывы хромосом. Эта специфичность была изучена на растениях, дрозофиле и клетках культуры тканей.

2. Межлокусная специфичность связана с определением частоты мутирования отдельных генов (вернее, конкретных аллелей). Такого рода специфичность находится под контролем всего генотипа и часто зависит от физиологического состояния биологического объекта. Например, известен штамм кишечной палочки с повышенной частотой мутирования к стрептомицинустойчивости, что связано с присутствием в этом штамме гена-мутатора, расположенного в половом факторе. При передаче полового фактора другим штаммам они также приобретают свойство мутировать с высокой частотой к стрептомицинустойчивости. Оказалось, что ген-мутатор может являться структурным геном ДНК-полимеразы.

3. Внутрилокусная специфичность включает исследование как прямых мутаций (определение "горячих точек"), так и обратных (аллельспецифичность). Изучение мутабельности на уровне 2-3 нуклеотидов проводил Бензер (S. Benzer, 1955, 1959) на области rll бактериофага Т4.

4. Специфичность, отражающая структурный характер изменения генетического материала, как отношение числа генных мутаций к числу хромосомных аберраций. Это соотношение варьирует в зависимости от мутагена: например, этоксикофеин вызывает только хромосомные разрывы, а небулярин индуцирует генные мутации. Однако этот эффект может зависеть также от организма: 5-бромдезоксиуридин индуцирует у микроорганизмов только генные мутации, а в культуре клеток человека способен вызывать разрывы хромосом.

При сравнении жизнеспособности индуцированных вариантов, полученных при действии химических и физических мутагенных агентов, также была обнаружена определенная специфичность. Так, под действием рентгеновых лучей и быстрых нейтронов возникают 4-5% жизнеспособных мутаций ячменя, а под действием окиси этилена - 9% и этиленимина - 20%. Исключительное положение по специфичности в этом отношении занимают нитрозоалкилмочевины, которые, в отличие от других химических и физических агентов, дают в опытах на растениях до 30-60% жизнеспособных наследственных изменений.

Специфичность действия мутагенов в зависимости от генотипа проявляется на разнообразных объектах. В опытах на высших растениях установлена различная степень устойчивости и мутабельности не только в пределах вида, семейства, но даже сорта.

Такие же закономерности были выявлены на микроорганизмах. Особенно ярко зависимость мутагенного эффекта от вида показана на актиномицетах. При этом различные виды актиномицетов и их штаммы неодинаковы и по своей чувствительности к мутагенам, и по мутагенному эффекту. Большое значение в различной устойчивости придается репаративным процессам.