Предмет и задачи микробиологии, вирусологии

ВВЕДЕНИЕ

В учебном пособии «Краткий курс лекций по микробиологии, вирусологии, иммунологии» для студентов специальности 060101.65 Лечебное дело представлен теоретический материал в виде лекций по общей и частной микробиологии, вирусологии, иммунологии в соответствии с учебной программой. В пособии также приведены сведения по морфологии, культуральным свойствам, ферментативной активности, антигенной структуре, факторам патогенности возбудителей, культуральным исследованиям, применяемым в практическом здравоохранении. Пособие состоит из 32 разделов.

Полученные знания по микробиологии, вирусологии, иммунологии помогут студентам разобраться в вопросах частной микробиологии, вирусологии, рационально подойти к выбору методов исследования. Владение данным материалом необходимо каждому врачу независимо от избранной им специальности, важно в процессе интерпретации результатов исследования при диагностике заболеваний в практической деятельности врача.

Плазмиды.

К прокариотам, объединяющим эубактерии и архебактерии, относят бактерии, низшие(сине-зеленые)водоросли, спирохеты, актиномицеты, архебактерии, риккетсии, хламидии, микоплазмы. Простейшие, дрожжи и нитчатые грибы – эукариоты.

Задачи медицинской микробиологии. К ним можно отнести установление этиологической (причинной) роли микроорганизмов в норме и патологии; разработка методов диагностики, специфической профилактики и лечения инфекционных заболеваний, индикации (выявления) и идентификации (определения) возбудителей; бактериологический и вирусологический контроль окружающей среды, продуктов питания, соблюдения режима стерилизации и надзор за источниками инфекции в лечебных и детских учреждениях; контроль за чувствительностью микроорганизмов к антибиотикам и другим лечебным препаратам, состоянием микробиоценозов (микрофлорой) поверхностей и полостей тела человека.

Микробный биоценоз Микроорганизмы – это не видимые простым глазом представи-

тели всех царств жизни. Они занимают низшие (наиболее древние) ступени эволюции, но играют важнейшую роль в экономике, круговороте веществ в природе, в нормальном существовании и патологии растений, животных, человека.

Микроорганизмы широко распространены в природе, организме человека, животных, растений. Видовой состав разнообразен, только бактерий насчитывается около 100 000 видов, грибов – до 250000видов.

Ворганизме человека обитает до 1014 только бактерий, не считая грибов, вирусов и простейших. Микроорганизмы, населяющие организм человека, составляют его микроэкологию и играют роль в обеспечении нормальной жизнедеятельности организма.

Микроорганизмы окружающей среды составляют макроэкологию, влияют на биологические и природные процессы на планете.

Виды взаимоотношений. Взаимоотношения между организмом и микробами могут иметь положительный или отрицательный характер сосуществования:

форма симбиоза, выгодного как для организма, так и для микроорганизмов (м/о), т.е. комменсализма;

форма паразитизма, когда м/о, существуя за счет организма, наносит ему ущерб.

Группы микроорганизмов. Все микроорганизмы подразделяют на патогенные, или болезнетворные, т.е. способные вызвать инфекционное заболевание; условно-патогенные, которые могут вызвать болезни при определенных условиях; сапрофиты, т. е. неболезнетворные (непатогенные) микробы, не вызывающие заболеваний у человека.

Роль микробов в патологии человека. Порядка 3 500 видов микроорганизмов патогенны для человека, из них около 1000 видов

– вирусы. Человек подвержен около 10 000 болезням, на долю инфекционных болезней приходится примерно 1/3 всех заболеваний человека. На 1/3 нозоформ приходится около 70 % всех случаев болезней у человека.

Разнообразие мира микробов обусловило дифференциацию микробиологии на ряд разделов и направлений.

Микробиология подразделяется на общую и частную.

Общая микробиология включает анатомию (структура микробов), физиологию, биохимию, генетику, эволюцию, экологию микробов.

Частная микробиология включает медицинскую бактериологию, вирусологию, микологию, протозоологию, санитарную, клиническую, техническую (биотехнология) микробиологию.

Медицинская микробиология изучает биологические свойства возбудителей инфекционных болезней, строение и физиологию микроорганизмов (условия роста и размножения, обмен веществ,

потребности в питании и т.д.), генетику микробов (строение генома, наследственность и изменчивость и т.д.), этиологию и патогенез инфекционных болезней, вызываемых микробами, экологические взаимоотношения, складывающиеся между миром микробов и человеком.

Практическое применение микробиологии. Микробиология изучает и разрабатывает методы специфической диагностики, профилактики и лечения инфекционных болезней. С помощью микробиологических методов проводятся эпидемиологические и санитар- но-гигиенические наблюдения и исследования.

Иммунология. Сущность и задачи. Сущностью иммунологии является изучение механизмов и способов защиты организма от генетически чужеродных веществ – антигенов – с целью поддержания и сохранения гомеостаза, структурной и функциональной целостности организма; антигенной индивидуальности каждого организма и вида в целом.

Иммунная система. Функции иммунной системы выполняет лимфатическая система, клетки: Т- иВ-лимфоцитыи фагоцитирующие клетки; факторы специфического и неспецифического иммунитета (комплемент, интерферон и др.).

Механизм действия иммунной системы сводится к распознаванию «чужого» и «своего», уничтожению, нейтрализации, деструкции «чужого».

Генетически чужеродными веществами являются экзогенно поступающие в организм антигены различного происхождения и эндогенно образующиеся антигены (аутоантигены, антигены опухолей, продукты молекулярных и клеточных мутаций и т.д.).

Вирусология. Сущность и задачи.

Вирусология изучает биологические свойства вирусов, физиологию, генетику вирусов, этиологию и патогенез инфекционных болезней, вызываемых вирусами.

Классификация вирусов. Основу классификации вирусов представляют тип нуклеиновой кислоты, ее структура, количество нитей; особенности воспроизводства генома; размер и морфология вирусов, количество капсомеров и тип симметрии нуклеокапсида; наличие суперкапсида, место размножения в клетке.

Роль микробиологии в работе врача. Инфекционные болезни находятся на 1-м месте среди болезней человека: около 70 % всех больных – это инфекционные больные. Врач любого профиля ЛПУ

должен иметь знания по диагностике, профилактике и лечению ВБИ.

Соматические болезни, лекарства и т. д. могут привести к дисбактериозам: врач должен знать, уметь анализировать эти состояния и учитывать при проведении лечения основной болезни. Широко распространены заболевания иммунной системы: врач должен знать эту патологию и уметь проводить лечение. В диагностике, профилактике и лечении онкоболезней важное место занимают иммуномодуляторы (интерлейкины, интерфероны и др.), адаптогены, иммунологические методы исследования. Иммунный конфликт между матерью и плодом на всех этапах репродукции ведет к тяжелым болезням. Поэтому педиатры, гинекологи, акушеры должны знать проблемы иммунологии репродукции. Отторжение трансплантата из-заиммунологической несовместимости реципиента и донора – врачи должны знать, как бороться с явлениями иммунологической несовместимости. Велико воздействие экологии на организм человека, микрофлору – врачи должны знать проблемы экологической и санитарной микробиологии. В арсенале врачей имеется большая группа иммунобиологических препаратов, противомикробных препаратов. Врач любой специальности должен знать методику их применения.

В заключение необходимо отметить теоретическое значение современной микробиологии, вирусологии и иммунологии. Научные достижения позволили изучить фундаментальные процессы жизнедеятельности на молекулярно-генетическомуровне. Они обусловливают современное понимание сущности механизмов развития многих заболеваний и направления их более эффективного предупреждения и лечения.

Лекция 2

Морфология бактерий.

Бактерии относятся к домену Bacteria, это одноклеточные прокариоты, имеют микроскопические размеры, измеряются в микрометрах (мкм) –10-6.

Прокариоты отличаются от эукариот по следующим признакам:

1. Отсутствие истинного дифференцированного ядра (ядерной

мембраны).

2.Отсутствие развитой эндоплазматической сети, аппарата Гольджи.

3.Отсутствие митохондрий, хлоропластов, лизосом.

4.Неспособность к эндоцитозу (захвату частиц пищи).

5.Клеточное деление не связано с циклическими изменениями строения клетки.

6.Значительно меньшие размеры. Большая часть бактерий имеет размеры 0,5-0,8(мкм) х2-3мкм.

По форме выделяют следующие основные группы бактерий:

сферические формы, или кокки, – размером0,5-1,0мкм, по взаимному расположению делятся на микрококки, диплококки, стафилококки, стрептококки, тетракокки.

палочковидные бактерии. Различаются по размерам, форме концов клетки, взаимному расположению клеток. Длина клеток ~1,0-10мкм, толщина ~0,5-2,0мкм, правильной (кишечная палочка и др.) и неправильной (коринебактерии и др.) формы, в т.ч. ветвящиеся (актиномицеты);

извитые;

нитевидные.

Кокковидные бактерии (кокки) по характеру взаиморасположе-

ния после деления подразделяются на ряд морфологических вариантов.

Микрококки (от греч. micros – малый) – отдельно расположенные клетки. Входят в состав нормальной микрофлоры, находятся во внешней среде. Заболеваний у людей не вызывают.

Диплококки (от греч. diplos – двойной), или парные кокки, располагаются парами (пневмококк, гонококк, менингококк). Деление этих микроорганизмов происходит в одной плоскости, образуются пары клеток.

Стрептококки (от греч. streptos – цепочка) – клетки округлой формы, составляют цепочку вследствие деления клеток в одной плоскости и сохранения связи между ними в месте деления.

Стафилококки (от греч. staphyle – виноградная гроздь) – кокки, расположенные в виде виноградной грозди в результате деления в разных плоскостях.

Тетракокки. Деление происходит в двух взаимоперпендикулярных плоскостях с образованием тетрад (т.е. по четыре клетки).

Сарцины. Делятся в трех взаимоперпендикулярных плоскостях, образуя тюки (пакеты) из 8,16-тии большего количества клеток. Часто обнаруживаются в воздухе.

Среди палочковидных форм микроорганизмов выделяют:

бактерии – палочки, не образующие спор;

бациллы – аэробные спорообразующие микробы. Диаметр споры обычно не превышает размера («ширины») клетки (эндоспоры);

клостридии – анаэробные спорообразующие микробы. Диаметр споры больше поперечника вегетативной клетки, в связи с чем клетка напоминает веретено или теннисную ракетку.

Извитые формы микроорганизмов:

вибрионы и кампилобактерии имеют один изгиб, могут быть в форме запятой, короткого завитка;

спириллы имеют2-3завитка;

спирохеты имеют различное число завитков, что определяет специфический характер движения и особенности строения различных представителей. Из большого числа спирохет наибольшее медицинское значение имеют представители трех родов – Borrelia, Treponema, Leptospira.

Ультраструктура бактериальных клеток. Различают постоян-

ные и непостоянные структуры бактериальной клетки:

постоянные структуры: клеточная стенка (КС), цитоплазматическая мембрана (ЦПМ), цитоплазма, нуклеоид, рибосомы;

непостоянные структуры: капсула, микрокапсула, слизь, жгутики, пили.

Лекция 3

Лекция 4

Лекция 5

ФИЗИОЛОГИЯ БАКТЕРИЙ

Физиология изучает жизненные функции бактерий: питание, дыхание, рост и размножение. В основе физиологических функций лежит непрерывный обмен веществ (метаболизм).

Обмен веществ – метаболизм – состоит из двух процессов: асси-

миляции (анаболизм) и диссимиляции (катаболизм). Процесс асси-

миляции – усвоение питательных веществ и использование их для синтеза клеточных структур (конструктивный обмен). Процесс диссимиляции – расщепление и окисление питательных веществ с синтезом АТФ, выделением энергии, необходимой для жизнедеятельности клетки (энергетический обмен). Все метаболические процессы совершаются с участием ферментов.

Питание бактерий

Особенности питания бактерий:

поступление питательных веществ через всю поверхность микробной клетки;

высокая скорость метаболических процессов;

способность быстро адаптироваться к изменяющимся условиям среды обитания.

По усвоению углерода м/о делятся на 2 типа: аутотрофы могут использовать для построения своих клеток неорганический углерод

ввиде СО2; гетеротрофы нуждаются в готовых органических соединениях: они могут усваивать углерод из углеводов, многоатомных спиртов, органических кислот, аминокислот и др. Гетеротрофы

всвою очередь делятся на сапрофиты и паразиты: сапрофиты получают готовые органические соединения от отмерших организмов (бактерии гниения), паразиты – за счет органических веществ живой клетки растений, животных или человека (риккетсии, вирусы и некоторые простейшие).

 

По усвоению азота микроорганизмы делятся на 2 группы: аминоавтотрофы: для синтеза белка используют молекулярный азот воздуха (клубеньковые бактерии, азотобактер) или усваивают его из аммонийных солей; аминогетеротрофы: получают азот из органических соединений – аминокислот, сложных белков (патогенные м/о, большинство сапрофитов).

Энергия запасается бактериальной клеткой в форме молекул АТФ. Выделяют фототрофы (источником энергии для них является свет); хемотрофы (энергию получают за счет окислительновосстановительных реакций).

По типу дыхания микроорганизмы делятся на: Облигатные (строгие) аэробы; Облигатные анаэробы;

Факультативные (необязательные) анаэробы.

Облигатные аэробы (микобактерии туберкулеза) – для их жизнедеятельности необходим свободный кислород. Реакции окисления идут при участии молекулярного кислорода с высвобождением большого количества энергии.

Облигатные анаэробы (клостридии столбняка, ботулизма и др.) способны жить и размножаться только при отсутствии свободного кислорода. Дыхание происходит путем ферментатизации субстрата с образованием небольшого количества энергии.

Факультативные анаэробы могут размножаться как при наличии кислорода, так и без него (большинство патогенных и сапрофитных бактерий).

Основные методы создания анаэробных условий для культивирования микроорганизмов.

1.Физический – откачивание воздуха, введение специальной газовой безкислородной смеси (чаще – N2 – 85%, CO2 – 10%, H2 – 5%).

2.Химический – применяют химические поглотители кислоро-

да.

3.Биологический – совместное культивирование строгих аэробов и анаэробов (аэробы поглощают кислород и создают условия для размножения анаэробов).

4.Смешанный – используют несколько разных подходов. Необходимо отметить, что создание оптимальных условий для

строгих анаэробов – очень сложная задача. Очень непросто обеспечить постоянное поддержание безкислородных условий культивирования, необходимы специальные среды без содержания растворенного кислорода, поддержание необходимого окислительновосстановительного потенциала питательных сред, взятие и доставка, посев материала в анаэробных условиях.

Существует ряд приемов, обеспечивающих более подходящие условия для анаэробов – предварительное кипячение питательных сред, посев в глубокий столбик агара, заливка сред вазелиновым маслом для сокращения доступа кислорода, использование герметически закрывающихся флаконов и пробирок, шприцев и лабораторной посуды с инертным газом, использование плотно закрывающихся эксикаторов с горящей свечой. Используются специальные приборы для создания анаэробных условий – анаэростаты. Однако в настоящее время наиболее простым и эффективным оборудованием для создания анаэробных и микроаэрофильных условий является система «Газпак» со специальными газорегенерирующими пакетами, действующими по принципу вытеснения атмосферного воздуха газовыми смесями в герметически закрытых емкостях.

Рост и размножение бактерий. Рост – увеличение размеров от-

дельной особи и упорядоченное воспроизведение всех клеточных компонентов и структур. Размножение – способность микроорганизмов к самовоспроизведению. Основной способ размножения: поперечное деление. Сначала идет удвоение молекул ДНК. Каждая дочерняя клетка получает копию материнской ДНК. Процесс деления считается законченным, когда цитоплазма дочерних клеток разделена перегородкой.

Размножение бактерий в жидкой питательной среде:

фаза 1 – исходная стационарная илилаг-фаза:адаптация клеток к питательной среде, повышение интенсивности обменных процессов, увеличение размера клетки. К концу фазы бактерии начинают размножаться;

фаза 2 – логарифмического роста: интенсивное размножение

– возрастание количества клеток в геометрической прогрессии;

фаза 3 – стационарная: количество клеток остается постоянным, т.к. число вновь появившихся клеток почти равно числу отмирающих клеток;

фаза 4 – отмирание: снижение жизнеспособности клеток, и их гибель. Причины: истощение питательной среды, накопление в ней вредных продуктов метаболизма, снижение количества молодых клеток.

 

 

Лекция 6

Лекция 7

ОБЩАЯ ВИРУСОЛОГИЯ

Открытие вирусов Д.И. Ивановским в 1892 г. положило начало развитию науки вирусологии. Быстрому ее развитию способствовали изобретение электронного микроскопа, разработка метода культивирования микроорганизмов в культурах клеток.

Слово «вирус» в переводе с латинского – яд (животного происхождения). Этот термин применяют для обозначения уникальных представителей живой природы, не имеющих клеточного (эукариотического или прокариотического) строения и обладающих облигатным внутриклеточным паразитизмом, т.е. не могут жить без клетки.

В настоящее время вирусология – бурно развивающаяся наука, что связано с:

ведущей ролью вирусов в инфекционной патологии человека (примеры: вирус гриппа, ВИЧ – вирус иммунодефицита человека, цитомегаловирус и другие герпесвирусы) на фоне практически полного отсутствия средств специфической химиотерапии;

использованием вирусов для решения многих фундаментальных вопросов биологии и генетики.

 

Вирусы – доклеточная форма существования живой материи, облигатные внутриклеточные паразиты, способные только к внутриклеточному размножению. Вирусы относятся к царству Vira.

Таксономические категории. Семейство имеет окончание viridae,

подсемейство – virinae, род – virus. Названия родов подсемейств даны не для всех вирусов. Вид вируса не получил биноминального названия, как у бактерий.

В основу классификации вирусов положены категории:

Тип НК (ДНК или РНК), ее структура, количество нитей (1 или 2).

Особенности репликации вирусного генома. Размер и морфология вирионов.

Количество капсомеров и тип симметрии нуклеокапсида. Наличие оболочки (суперкапсида).

Место размножения в клетке. Антигенные свойства и др.

Основные свойства вирусов. Ультрамикроскопические размеры, нм (от 15-20 до 350-400 нм). Один тип нуклеиновой кислоты – ДНК или РНК. Отсутствие способности к росту и бинарному делению. Размножение за счет воспроизводства себя из собственного генома. Отсутствие собственных систем мобилизации энергии. Отсутствие способности к синтезу белка. Среда обитания: бактерии, клетки растений, животных и человека.

Структура вириона. Различают: просто устроенные вирусы

(вирусы полиомиелита, гепатита А), которые состоят из нуклеиновой кислоты и капсида; сложно устроенные вирусы (вирусы кори, гриппа, герпеса, коронавирусы), состоящие из нуклеиновой кислоты, капсида и липопротеиновой оболочки (суперкапсид). В центре вириона – нуклеиновая кислота, окруженная капсидом. Капсид состоит из белковых субъединиц – капсомеров. Количество капсидов и способ их укладки строго постоянны для каждого вида вируса (вирус полиомиелита – 32 капсомера, аденовирус – 252). Суперкапсид у сложных вирусов образуется при выходе его из клетки хозяина. Вирусный капсид обволакивается внутренней поверхностью цитоплазматической мембраны клетки хозяина, и образуется один или несколько слоев оболочки – суперкапсид (вирусы бешенства, герпеса, энцефалита). У некоторых вирусов от внешнего липидного слоя оболочки выступают капсомеры в виде шипов – пепломеры (вирус гриппа). Нуклеиновая кислота вируса является носителем наследст-

венных свойств. Капсид и суперкапсид несут защитные функции, а также способствуют проникновению вируса в клетку.

Морфология вириона. В зависимости от способа укладки капсида различают формы: кубическую (икосаэдрическая); сферическую; палочковидную; пулевидную; спермазоидную.

Химический состав вирусов. Количество и содержание ДНК и РНК вирусов не одинаковы. Белки содержатся в незначительном количестве, состоят из16-20-иаминокислот. Функции: антигенные свойства, защита от ферментов клетки хозяина. Липиды и углеводы содержатся во внешней оболочке вирионов. Их источником является оболочка клетки хозяина. Ферменты вирусов. У большинства вирусов нет ферментов, т.к. они не имеют собственного метаболизма. Некоторые вирусы имеют ферменты, способствующие их проникновению в клетку хозяина (вирус гриппа А – нейраминидаза, фаги – лизоцим).

Пути передачи вирусов: воздушно-капельный(грипп, оспа), алиментарный (полиомиелит, гепатит А),контактно-бытовой(бешенство), трансмиссивный (энцефалит).

Пути проникновения вируса в клетку хозяина: рецептор-

зависимый эндоцитоз (виропексис), слияние оболочки вируса с клеточной мембраной.

Рецептор-зависимый эндоцитоз (виропексис): сначала идет ад-

сорбция вириона и клетки и далее захватывание и поглощение вириона клеткой. Клеточная мембрана с прикрепленным вирионом впячивается, образуется внутриклеточная вакуоль с вирусом. Содержимое вакуоли закисляется, вирусный нуклеокапсид выходит в цитоплазму клетки-хозяина.

Слияние оболочки вируса с клеточной мембраной характерно только для сложных вирусов (белки слияния). Происходит точечное взаимодействие вирусного белка слияния с липидами клеточной мембраны, вирусная липопротеиновая оболочка интегрируется с клеточной мембраной, а внутренний компонент попадает в цитоплазму клетки-хозяина.

Репликация вируса в клетке хозяина:

«Раздевание вируса» (депротеинизация). Удаляются поверхностные структуры: оболочка и капсид, высвобождается вирусная НК и транспортируется к местам депротеинизации.

Синтез вирусных компонентов. Происходит репликация НК и синтез вирусных белков при участии ДНК или РНК клетки хозяина.

Формирование вирусов – самосборка белковых частиц вокруг вирусной НК.

У одних вирусов самосборка происходит в цитоплазме, у других – в ядре клетки хозяина.

Образование внешней оболочки всегда происходит в цитоплазме.

Выход вирусов из клетки хозяина:

Взрывной путь: из погибающей клетки одновременно выходит большое количество вирионов. По взрывному пути выходят из клетки вирусы, не имеющие липопротеиновой оболочки.

Почкование, экзоцитоз характерно для сложных вирусов. Образовавшийся нуклеокапсид вириона транспортируется к мембранам клетки, в области контакта нуклеокапсида вириона с клеточной мембраной начинается выпячивание этих участков. Клетка способна длительно сохранять жизнеспособность и продуцировать вирусное потомство.

Типы взаимодействия вируса и клетки хозяина:

Продуктивный тип завершается образованием нового поколения вирионов и гибелью зараженных клеток. Гибель (лизис) клеток (цитопатический эффект) – результат интенсивного размножения и формирования большого количества вирусных частиц. Это характерный результат продуктивного процесса, вызванного вирусами с высокой цитопатогенностью. Цитопатический эффект действия на клеточные культуры для многих вирусов носит достаточно узнаваемый специфический характер; стабильное взаимодействие, не приводящее к гибели клетки (персистирующие и латентные ин-

фекции) – так называемая вирусная трансформация клетки.

Абортивный тип – новые вирионы не образуются, т.к. инфекционный процесс прерывается на одном из этапов. Когда клетки освобождаются от вируса при инфицировании дефектным вирусом, для репликации которого нуженвирус-помощник,самостоятельная репликация этих вирусов не возможна. Например, вирус дельта (D) гепатита может реплицироваться только при наличии вируса гепатита B, егоHbs-антигена,аденоассоциированный вирус – в присутствии аденовируса); при инфицировании вирусом генетически не чувствительных к нему клеток; при заражении чувствительных клеток вирусом в определенных условиях.

Интегративный тип, или вирогения – встраивается вирусная ДНК в хромосому клетки и совместно сосуществует. Обеспечивается синхронность репликации вирусной и клеточной ДНК. Встраиваться в ДНК-геном хозяина могут только ДНК-вирусы (принцип «ДНК в ДНК»). Единственные РНК-вирусы, способные интегрироваться в геном клетки хозяина, – ретровирусы – имеют для этого специальный механизм. Особенность их репродукции: синтез ДНК провируса на основе геномной РНК с помощью фермента обратной транскриптазы с последующим встраиванием ДНК в геном хозяина.

Генетика вирусов. Геном вирусов содержит от 6 до нескольких сотен генов. Представлен различными видами нуклеиновых кислот:2-нитевыми,1-нитевыми,линейными, кольцевыми, фрагментированными. СредиРНК-содержашихвирусов различают:

Вирусы сплюс-нитьюРНК: (+)нить несет наследственную информацию и функцию иРНК.

Вирусы с(-)нитьюРНК:(-)нитьвыполняет только наследственную функцию.

Мутации вирусов:

Мутации могут возникнуть во время репликации нуклеиновой кислоты. Природа мутагенов: физические и химические факторы.

Генетическая рекомбинация – одновременное заражение клетки хозяина двумя вирусами, при этом возможен обмен отдельными генами между вирусами. Образуются рекомбинанты, содержащие гены двух родителей.

Генетическая реактивация генов происходит при скрещивании инактивированного вируса с полноценным, что приводит к спасению инактивированного вируса.

Методы культивирования вирусов:

вирусы размножаются только в жизнеспособных клетках; вирусы культивируют в куриных эмбрионах;

вкультурах ткани человека и животных;

ворганизме чувствительных животных.

Культивирование вирусов в куриных эмбрионах проводится в разных местах эмбриона: на хорион-аллантоисную оболочку; в аллантоисную полость; амниотическую полость; желточный мешок. Температурный режим и длительность инкубации зависит от биологических свойств введенного вируса.

Культивирование вирусов в культуре клеток

Используют ткани человека и различных животных. Однослойные культуры клеток выращивают в стеклянных плоских сосудах-матрицах. Присутствие вирусов в культурах тканей обнаруживают по изменению клеток. Тип вируса определяют реакцией нейтрализации типоспецифическими сыворотками.

Типы клеточных культур:

1. Первичные (трипсинизированные) культуры – фибробласты эмбриона курицы (ФЭК), человека (ФЭЧ), клетки почки различных животных и т.д. Первичные культуры получают из клеток различных тканей чаще путем их размельчения и трипсинизации. Используют их однократно, т.е. постоянно необходимо иметь соответствующие органы или ткани.

2. Линии диплоидных клеток пригодны к повторному диспергированию и росту, как правило, не более20-ипассажей (т.к. теряют исходные свойства).

3. Перевиваемые линии (гетероплоидные культуры), способны к многократному диспергированию и перевиванию, т.е. к многократным пассажам, наиболее удобны в вирусологической работе, например, линии опухолевых клеток Hela, Hep и др.

Специальные питательные среды для культур клеток

Используются разнообразные синтетические вирусологические питательные среды сложного состава, включающие большой набор различных факторов роста – среда 199, игла, раствор Хэнкса, гидролизат лактальбумина. В среды добавляют стабилизаторы рН (Hepes), различные в видовом отношении сыворотки крови (наиболее эффективной считают эмбриональную телячью сыворотку), L- цистеин иL-глютамин.

В зависимости от функционального использования среды могут быть ростовые (с большим содержанием сыворотки крови), их используют для выращивания клеточных культур до внесения вирусных проб, и поддерживающие (с меньшим содержанием сыворотки или ее отсутствием) для содержания инфицированных вирусом клеточных культур.

Проявления вирусной инфекции клеточных культур:

1.Цитопатический эффект.

2.Выявление телец включений.

3.Выявление вирусов методом флюоресцирующих антител (МФА), электронной микроскопией, авторадиографией.

4.Цветная проба. Обычный цвет используемых культуральных сред, содержащих в качестве индикатора рН феноловый красный, при оптимальных для клеток условиях культивирования (рН около 7,2) – красный. Размножение клеток меняет рН и, соответственно, цвет среды с красного на желтый за счет смещения рН в кислую сторону. При размножении в клеточных культурах вирусов происходит лизис клеток, изменения рН и цвета среды не происходит.

5.Выявление гемагглютинина вирусов – гемадсорбция, гемагглютинация.

6.Метод бляшек (бляшкообразование). В результате цитолитического действия многих вирусов на клеточные культуры образуются зоны массовой гибели клеток. Выявляют бляшки – вирусные «клеточно-негативные»колонии.

Методы идентификации вирусов: РГА (реакция гемагглютина-

ции); РТГА (реакция торможения гемагглютинации); РНГА (реакция непрямой гемагглютинации); РПГА (реакция прямой гемагглютинации); РСК (реакция связывания комплемента).

Бактериофаги

Бактериофаги – вирусы бактерий. Фаги могут инфицировать и разрушать только молодые развивающиеся клетки, являясь их паразитами.

Морфология фагов: фаги состоят из головки и хвостового отростка. Размеры фагов, форма и величина головки, длина и строение отростка различны у разных фагов.

Химический состав фагов. Как и все вирусы, фаги состоят из НК одного типа и белка. Молекула НК, скрученная в спираль, находится в головке фага. Капсид фага и отросток имеют белковую природу. На свободном конце отростка содержится литический фермент (лизоцим).

Специфичность фагов. Фаги обладают строгой специфичностью. Различают виды специфичности: видовая – способны паразитировать только в определенном виде бактерий (стрептококковый, стафилококковый, холерный и т.д.); типовая – способны паразитировать только на определенных представителях данного вида; поливалентная – способность лизировать бактерии близких видов (виды из рода возбудителей дизентерии (шигелл).

Взаимодействие фага с клеткой. Весь цикл взаимодействия фага с клеткой проходит в разных системах «фаг-бактерия» от нескольких минут до 1-2 ч в несколько стадий:

адсорбция – с помощью нитей хвостового отростка фаг адсорбируется на поверхностных рецепторах клетки. Адсорбция фагов специфична;

проникновение – стержень фага «прокалывает» клеточную стенку. Фермент, находящийся в отростке (лизоцим), разрушает ЦПМ. Чехол отростка сокращается, через канал стержня НК фага «впрыскивается» в клетку. Пустая белковая оболочка остается снаружи;

репродукция – репродукция белка и НК фага происходит внутри клетки;

сборка и формирование зрелых частиц фага;

лизис клетки и выход зрелых частиц фага из нее. Разрывается клеточная стенка, и в окружающую среду выходит несколько сотен новых фагов, способных поражать свежие клетки.

Практическое применение фагов: фагопрофилактика и фаготе-

рапия – предупреждение и лечение инфекций с помощью фагов. Фагодиагностика: идентификация выделенных культур; определение неизвестного фага по тест-культуремикробов; ускоренный метод диагностики инфекций с помощью реакции нарастания титра фага.

Лекция 8

Лекция 9

ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ

Особенности бактерий в генетическом аспекте

относительная простота генома (сопокупности нуклеотидов хромосом);

гаплоидность (один набор генов), исключающая доминантность признаков;

различные интегрированные в хромосомы и обособленные фрагменты ДНК(IS-последовательности,транспозоны, плазмиды);

половая дифференциация в виде донорских и реципиентных клеток;

легкость культивирования, быстрота накопления биомасс.

Этапы эволюции генетической системы:

Кодон → ген → оперон → геном вирусов и плазмид → хромосо-

ма прокариот (нуклеоид) → хромосома эукариот (ядро).

Ген – это универсальная структурная единица живой материи, которая обеспечивает единство и многообразие всех форм существования жизни, ее непрерывность и эволюцию. Ген является единственным носителем и хранителем жизни, а ег