Определение количества клеток высевом в жидкие среды (метод предельных разведений)

Используется таблица. Мак-Креди (наиболее вероятное количество клеток микроорганизмов в единице объема исходной суспензии.

(Руководство к практическим занятиям по микробиологии. Егоров Н.С. МГУ, М. 1995. Стр.126-127)

Контрольные вопросы

1. На какие группы можно разделить методы количественного определения микроорганизмов?

2. Что собой представляет камера Горяева и особенности работы с ней?

3. Как ведется подсчет клеток в капиллярах Перфильева?

4. Особенности подсчета клеток на фиксированных окрашенных мазках.

5. Как применяют мембранные фильтры для подсчета клеток?

6. Подсчет колоний при высеве на плотные питательные среды.

7. Метод предельных разведений.

8. Из каких этапов состоит определение биомассы?

9. Какими способами отделяют микроорганизмы от среды?

10. Суть нефелометрического метода при определении количества клеток и биомассы.

Рекомендованный материал

1. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. Егоров Н.С. МГУ, М. 1995. Стр. 117-132.

2. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. «Спец.литература», С-Петербург. 1998. Стр. 107-110.

3. Медицинская микробиология. Гл. ред. Покровский В.И., Поздеев О.К. «ГЭОТАР Медицина». М., 1999. Стр. 996-1000.

5. Тимаков В.Д., Левашев В.С., Борисов Л.Б. Микробиология. «Медицина», М. 1983. Стр. 124-132.

5. Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии. «Колос», М.!972. Стр.72-75, 142-157.

 

ЗАНЯТИЕ 9

ТЕМА: Условия культивирования и хранения культур микроорганизмов.

Вопросы для рассмотрения.

1. Факторы культивирования микроорганизмов (кислотность среды, аэрация, температура, свет, влажность).

2. Культивирование аэробных микроорганизмов.

3. Культивирование анаэробных микроорганизмов.

4. Периодическое и непрерывное культивирование.

5. Способы существования и типы жизни у прокариот.

6. Способы хранения микроорганизмов.

Задание для выполнения лабораторной работы

1. Заложить культуру гриба Penicillium, Fusarium, Mucor на хранение «под минеральным маслом».

 

В зависимости от того, какой источник знергии могут использовать прокариоты, их разделяют:

1) по источнику получения энергии

Фототрофы органотрофы

свет окслительно- восстановительные реакции

2) электронов в энергетических процессах

Органотрофы литотрофы

органические соединения неорганические соединения

3) по источнику углерода

Автотрофы гетеротрофы

углекислота органические соединения

Способы существования прокариот

Источ-ник энер- гии	Донор электро- нов	Источник углерода	Способ существования	Представители прокариот
Окислительно восстановительная реакция	Неорганические соединения (Н2, Н2S, NH3, Fe2+)	СО2	Хемолитоавто- трофы	Нитрифицирующие, тионовые, водородные бактерии; ацидофильные железобактерии
Органические соединения	Хемолитогетеро- трофы	Метанообразующие, водородные бактерии
Органические соединения	СО2	Хемоорганоавто- трофы	Факультатывные метилотрофы,окисляющие муравьиную кислоту
Органические соединения	Хемоорганогете- ротрофы	Большинство прокариот
Свет	Неорганические соединения (Н2О, Н2S, S)	СО2	Фотолитоавто- трофы	Цианобактерии, пурпурные и зеленые
Органические соединения	Фотолитогетеро- трофы	Некоторые цианобактерии, пурпурные и зеленые
Органические соединения	СО2	Фотоорганоавто- трофы	Некоторые пурпурные бактерии
Органические соединения	Фотоорганогете- ротрофы	Пурпурные и некоторые зеленые бактерии,галобактерии, некоторые цианобактерии

Контрольные вопросы.

1. Какие микроорганизмы относятся к аэробам, анаэробам (облигатным, факультативным), микроаэрофилам?

2. Микроорганизмы по отношению к температуре: психрофилы (облигатные, факультативные), мефозилы, термофилы (термотолератные, факультативные, облигатные, экстремальные).

3. Значение активной кислотности среды для микроорганизмов.

4. Значение света и воды для культивирования микроорганизмов. Активность воды.

5. При каких условиях и как культивируются аэробные микроорганизмы?

6. Особенности культивирования анаэробных микроорганизмов. Способы культивирования.

7. Что такое периодическое и непрерывное культивирование?

8. Способы хранения микроорганизмов, их суть.

Рекомендованный материал

1. Гусев М.В., Минеева Л.А. Микробиология. МГУ, М. 1985. Стр. 94-108.

2. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. Егоров Н.С. МГУ, М. 1995. Стр. 18-19, 56-70.

 

 

ЗАНЯТИЕ 10

ТЕМА: Определение состава клеток микроорганизмов.

Вопросы для рассмотрения.

1. Методы разрушения клеток.

2. Определение белков.

3. Анализ нуклеиновых кислот.

4. Выделение и анализ полисахаридов.

5. Изучение состава клеточных стенок микроорганизмов.

Задание для выполнения лабораторной работы.

1. Разрушить клетки микроорганизмов одним из методов

I.Методы разрушения клеток микроорганизмов.

1. Гомогенизация — для микроорганизмов с тонкой клеточной стенкой, не имеющих клеточной стенки, для растительных и животных клеток.

Делается суспензия клеток в буферном растворе. Контролируют степень разрушения в фазово-контрастном микроскопе или по белку, освобожденному из клеток.

2. Растирание клеток с абразивами.

В качестве абразивов используется кварцевый песок, толченое кварцевое стекло, пудру окиси алюминия. Также используется растирание замороженных клеток в жидком азоте, где абразивом выступают кристаллы льда. После растирания к полученной массе добавляют равный объем буферного раствора и центрифугируют для удаления абразивов, не разрушенных клеток и их обломков.

3. Разрушение со стеклянными бусами.

Растирают микроорганизмы с прочной клеточной стенкой — дрожжи. Метод основан на механическом растирании клеток, попадающих между двумя мелкими стеклянными шариками. На 1 г клеточной массы добавляют 1-3 г отмытых охлажденных шариков.

4. Обработка ультразвуком

При этом разрушении происходит механический разрыв клеток за счет вибрации. Необходим строгий контроль за нагревом излучателя и температурой материала. Излучатель охлаждают холодной проточной водой, а пробу — в воде со льдом. Для усиления эффекта используют абразивы. Полноту разрушения контролируют микроскопически. Актиномицеты, грибы и дрожжи разрушаются с трудом.

5. Френч-пресс.

Основан на перепаде давления от высокого (1550-1400) к низкому (атмосферному). Перепад давления взрывает клетки изнутри. Контролируют полноту разрушения микроскопически или по увеличению вязкости жидкости (в результате выхода ДНК).

6. Х - пресс.

Используют замороженные клетки в буферном растворе при -70 С.

Затем продавливают через тонкую фильеру с помощью гидравлической системы. Клетки разрушаются от перепадов давления от атмосферного до высокого.

7. Лизис клеток с применением ферментов.

Добавляют буферный раствор и фермент к небольшой биомассе и таким образом получают сферопласты и пропопласты.

8. Лизис клеток с помощью детергентов.

Клетки промывают несколько раз буферным солевым раствором и добавляют детергент (тритон Х-100), инкубируют на льду.

9. Лизис клеток в присутствии органических растворителей.

Используют невысокую концентрацию (0,1-1,0%) толуола. Применяют для микроорганизмов, осажденных на фильтрах.

10. Лизис осмотическим шоком.

Используют высокую концентрацию солей или углеводов. Далее разводят дистиллированной водой в 10-50 раз. Используют для микроорганизмов с тонкой клеточной стенкой или при ее отсутствии.

11. Лизис с помощью замораживания-оттаивания.

Замораживают с жидким азотом, оттаивают в теплой воде. Позволяет обрабатывать большое количество биомассы.

Определение состава клеток микроорганизмов.

I. Определение белка.

1. Измерение поглощения при 280 нм.

Этот метод основан на поглощении тирозиновых, фенилаланиновых и триптофановых остатков; нуклеиновые кислоты могут вносить значительный вклад в адробцию, если присутсвуют в пробе, так как максимум поглощения при 260 нм. Если образец сильно загрязнен нуклеиновыми кислотами, то вноситься поправка. Используют кварцевые кюветы, так как стеклянные и пластиковые кюветы поглощают ультрафиолетовый свет.

2. Определение белка по Бредфорду.

Метод основан на количественном связывании белков с красителям, который реагирует с очищенными белками. В пробу добавляют рабочий раствор красителя и определяют оптическую плотность раствора при 595 нм.

3. Определение белка по Лоури.

Определение ведется при длине волны 750 нм. Это наиболее точный метод определение беков, но присутствует отрицательное влияние многих соединений, но это может быть преодолено осаждением белка перед определением, для чего применяется ТХУ (трихлоруксусная кислота) и дезоксалат натрия: добавляют реактивы, выдерживают 20-30 мин и измеряют оптическую плотность.

II. Определение нуклеиновых кислот.

Включает этапы:

1) выделение ДНК — разрушение клеток;

2) очистка ДНК (от белков) используют смеси хлороформ - изоамиловый спирт или фенол-хлороформ; переосаждение этанолом. От следов белка избавляются с помощью протеаз, от РНК — РНКазы. Ели необходимо сохранять, ДНК сушат под вакуумом и хранят при 4 ⁰С;

3) определение нуклеотидного состава ДНК.

Определение нуклеотидного состава ДНК.

1. Метод тепловой денатурации основан на разрушении водородных связей между комплементарными цепями ДНК и их расхождение при повышении температуры раствора ДНК.

2.Метод определения состава ДНК по плавучей плотности. Если раствор ДНК подвергнуть высокоскоросотному центрифугированию в градиенте плотности СsCl, то через определенное время она займет в градиенте место, соответствующее своей плавучей плотности.

III. Определение поли-β-оксимасляной кислоты (ПБОМК).

Для экстракции ПБОМК из клеток биомассу после охлаждения высушивают смесью диэтилового эфира и метанола. ПБОМК экстрагируют из навески биомассы смесью хлороформа и метанола при 60 ⁰С в течение 20 минут Экстракт упаривают досуха под вакуумом. Осадок растворяют в 1н серной кислоте и измеряют оптическую плотность при 235.

IV. Выделение и анализ полисахаридов.

Из культуральной жидкости полисахариды выделяют осаждением 5 объемами этанола или изопропанола. Осадок, который образуется за 24 часа при комнатной температуре, отделяют центрифугированием и сушат его на воздухе.

Количество редуцирующих сахаров в гидролизате полисахарида определяют по восстановлению 2,3,5-трифенилтетразолия хлористого (ТТХ). Качественный моносахаридный состав полисахарида определяют методом тонкослойной хроматографии.

V. Анализ состава клеточных стенок микроорганизмов.

У большинства бактерий главным полимером клеточной стенки является пептидогликан.

1. Выделение и очистка фракций клеточных стенок.

Клетки грамположительных бактерий механически разрушают, центрифугируют и наблюдают два слоя: нижний - неразрушенные клетки и верхний клеточные стенки студенистой консистенции. Верхний слой отдельно промывают водой, лиофилизируют. Высушенную массу стенок бактерий экстрагируют трихлоруксусной кислотой (ТХУ). Смесь и осадок стенок отмывают водой при центрифугировании до нейтральной кислотности. Осадок суспендируют в буферном растворе и обрабатывают трипсином в течение 20 минут. Далее осадок промывают буфером, 2%-ным дезоксихолатом натрия. Отмывают 1 н хлоридом натрия, дистиллированной водой. Высушивают спиртом или эфиром и досушивают в вакуум-эксикаторе.

2. Анализ состава пептидогликана (ПГ).

Выделенный и очищенный ПГ помещают в ампулу, добавляют 4 н соляную кислоту и инкубируют 16 часов при 100 ⁰С. Анализ гидролизата проводят на аминокислотном анализаторе, после чего вычисляют мольное отношение аминокислот, мурамовой кислоты и глюкозамина. В том случае, если обнаруживается диаминопимелиновая кислота, то определяют ее стереоизомер.

Контрольные вопросы

1. Назвать механические способы разрушения клеток микроорганизмов.

2. Как проводится растирание клеток с абразивами?

3. Объяснить понятия «Х-пресс», «Френч-Пресс».

4. Какими методами можно определить белок в клетке микроорганизма?

5. Какие этапы включает определение нуклеиновых кислот?

6. Какими методами определяется нуклеотидный состав ДНК?

7. Особенности определения поли-β-оксимасляной кислоты в клетках микроорганизмов?

8. Как проводится выделение фракций клеточных стеной бактерий?

Рекомендованный материал

1. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. МГУ, М. 1995. Стр.133-150.

 

 

ЗАНЯТИЕ 11

ТЕМА: Методы изучения генетики микроорганизмов.

Вопросы для рассмотрения.

1. Меры предосторожности при работе с мутагенами.

2. Мутагены, используемые для получения мутаций у микроорганизмов.

3. Отбор мутантных клеток.

4. Способы переноса генетической информации у бактерий.

Задание для выполнения лабораторной работы

1. Получить мутантные клетки микроорганизмов с помощью непрямого метода отбора, методом отпечатков.

 

Меры предосторожности при работе с мутагенами.

1. Любую работу с химическими мутагенами необходимо проводить в вытяжном шкафу, рабочая поверхность которого застелена фильтровальной бумагой.

2. Руки должны быть защищены резиновыми или пластиковыми перчатками.

3. Растворы мутагенов запрещается набирать ртом; пользоваться только пипеткой с грушей, автоматическими пипетками.

4. Растворы мутагенов запрещается сливать в раковину; можно пропитать ими любую гигроскопичную среду и поместить в герметичный контейнер, подобно другим опасным отходам.

5. При работе с источниками УФ-лучей следует защищать глаза стеклянными очками.

Генетическая информация у бактерий способна переноситься способами: трансформацией, трансдукцией, конъюгацией.

Трансформация –это непосредственная передача генетической информации или генетического материала (фрагмента ДНК) клетки-донора в клетку-реципиент и наблюдение ее наследственных изменений.

Процесс трансформации бактерий можно разделить на несколько этапов:

1) адсорбция ДНК донора на клетке-реципиенте;

2) проникновение ДНК внутрь клетки-реципиента;

3) соединение ДНК с гомологичными участками хромосомы реципиента с последующей рекомбинацией.

Эффективность спаривания трансформирующей ДНК с соответсвующим участком хромосомы реципиента зависит от степени гомологичности ДНК донора и реципиента. Чем выше гомологичность (комплементарность), тем эффективнее спаривание, что и определяет конечный результат, то есть количество формирующихся рекомбинантов (трансформантов).

Трансдукцией называют процесс переноса генетической информации из клетки-донора в клетку-реципиент, осуществляемый фагом.

Различают три типа трансдукции:

1) неспецифическую (общую);

2) специфическую;

3) абортивную.

При специфической трансдукции в клетке реципиентного штамма вместе с фаговой ДНК могут быть перенесены любые гены донора. Перенесенный фрагмент ДНК бактерии-донора способен включаться в гомологичную область ДНК клетки-реципиента путем рекомбинации. Фаги являются только переносчиками генетического материала от одних бактерий к другим, поскольку сама фаговая ДНК не участвует в образовании трансдуктантов.

Специфическая трансдукция характеризуется способностью фага переносить определенные гены от клетки-донора к клетке-реципиенту. При воздействии трансдуцирующих фагов с клетками реципиентного штамма, происходит включение гена бактерии-донора вместе с ДНК дефектного фага в хромосому бактерии-реципиента.

При абортивной трансдукции принесенный фагом фрагмент ДНК клетки-донора не включается в хромосому клетки-реципиента, а располагается в ее цитоплазме и может в таком виде функционировать. Во время деления бактериальной клетки трансдуцированный фрагмент ДНК донора может передаваться только одной их двух дочерных клеток, то есть наследоваться однолинейно и в конечном итоге утрачиваться в потомстве.

Конъюгацией называют процесс переноса генетической информации из клетки-донора в клетку-реципиент при непосредственном контакте между собой, при их скрещивании. Процесс конъюгации у бактерий обусловлен наличием в клетках-донорах конъюгативных плазмид (F-плазмид, F⁺). F-плазмида контролирует синтез половых ворсинок, которые способствуют эффективному спариванию Бактериальные клетки, не имеющие полового фактора (F-плазмид), не способны быть генетическими донорами, а только реципиентным генетическим материалом и обозначаются как F^— клетки. При скрещивании F⁺ с F^— клеткой почти все реципиентные клетки получают половой фактор и становятся F⁺ клетками.

Плазмиды выполняют несколько функций:

1) регуляторную, которая состоит в компенсации нарушений метоболизма ДНК клетки-хозяина;

2) кодирующую, которая состоит во внесении в бактериальную клетку новой информации, о которой судят по приобретенному признаку.

Важным свойством F –плазмиды является способность включаться в определенные участки бактериальной хромосомы и становиться ее частью. В некоторых случаях F-плазмида высвобождается из хромосомы, захватывая при этом сцепленные с ней бактериальные гены. Такие F-плазмиды обозначаются с указанием сокращенного латинского названия включенного в ее состав гена (например, F_lac).

Плазмиды, а также транспозоны, Is-последовательности, эписомы являются внехромосомными факторами наследственности, так как они не являются генетическими элементами, жизненно необходимыми для бактериальной клетки, поскольку не несут информации о синтезе ферментов, учавствующих в метаболизме.

Транспозпны представляют собой нуклеотидные последовательности, вклющающие от 2000 до 20500 пар нуклеотидов (п.н.). При включении в бактериальную ДНК они вызывают в ней дупликации, а при перемещении-делеции и инверсии. Транспопзоны имеют особые концевые структуры нескольких типов, которые являются маркерами, позволяющими отличать от других фрагментов ДНК.

Is-последовательности – это фрагменты ДНК, длиной 100 п.н. и более. В Is-последовательностях содержится информация, необходимая только для их транспозиции, то есть перемещения в различные участки ДНК.

Эписомы еще более крупные и сложные саморегулирующиеся системы, содержащие Is-последовательности и транспозоны; способны реплицироваться в любом из двух своих альтернативных состояний – автономном или интегрированном – в хромосому клетки-хозяина. К эписомам относятся различные умеренные лизогенные фаги. Эписомы имеют собственную белковую оболочку и более сложный цикл репродукции, чем у других внехромосомных факторов наследственности. Собственно эписомы – это вирусы, обладающие способностью переходить из одного генома в другой.

Контрольные вопросы

1. Классификация мутаций: 1) по происхождению; 2) по количеству мутировавших генов; 3) по фенотипическим последствиям.

2. Какие мутагены используют для получения мутантных клеток микроорганизмов?

3. Как проводиться прямой отбор мутантных клеток?

4. Какие способы используются при непрямом отборе мутантных клеток?

5. Как происходит процесс трансформации у бактерий?

6. Специфическая, неспецифическая, абортивная трансдукция.

7. Чем обусловлен процесс конъюгации у бактерий?

8. Какие внехромосомные факторы наследственности присущи бактериям? Рекомендованный материал

1. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. Егоров Е.Н. МГУ, М. 1995. Стр. 172-188.

2. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. Под ред. Борисова

Л. Б., Смирновой А.М. «Медицина», М. 1994. Стр. 81-105.

3. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. «Спец.литература», С-Петербург. 1998. Стр.84-106

4. Медицинская микробиология. Гл. ред. Покровский В.И., Поздеев О.К. «ГЭОТАР Медицина», М. 1999. Стр. 39-60.

 

 

ЗАНЯТИЕ 12