ТЕМА: Техника микробиологических исследований.

Вопросы для рассмотрения:

1.Приготовление почвенной суспензии для микробиологического анализа.

2. Техника посева петлей, иглой шпателем, пипеткой.

Задание для выполнения лабораторной работы:

1. Посев на питательные среды микрофлоры воздуха, почвы, воды.

 

Универсальным инструментом для производства посевов является бактериальная петля. Кроме неё, для посева уколом применяют специальную бактериальную иглу, а для посева на чашках Петри – металлические или стеклянные шпатели.Для посевов жидких материалов наряду с петлей используют пастеровские и градуированные пипетки.

Выращивание микроорганизмов на питательных средах называется культивированием (лат. cultivire - выращивание); развивавшиеся микроорганизмы – культурой. При развитии в жидкой среде культуры образуют суспензии, осадок или пленку; при развитии в плотной среде – колонии. Культуры могут быть чистыми (содержат потомство клеток одного вида микроорганизма). Внесение клеток микроорганизмов или какого – либо исследуемого материала (образца почвы, пробы воды) в стерильную питательную среду для получения чистой или накопительной культуры называется посевом. Перенесение уже выращенных клеток из одной среды в другую (стерильную) называется пересевом или пассированием.

Обычно микроорганизмы выращивают при определенной температуре в термостатах или термостатных комнатах. Культивирование при заданной температуре называется инкубацией, или инкубированием (лат. incubabion – выращивание при искусственно созданной температуре).

Приготовление почвенной суспензии

Для посева и техника посева

Перед проведением микробиологического анализа влажную или сухую хорошо перемешанную почву высыпают на стерильное стекло; стекло стерилизуют спиртом и обжигают на пламенем горелки. Почву тщательно перемешивают шпателем, раскладывают ровным слоем, удаляют корешки и другие посторонние включения и тщательно отбирают средний образец, для чего почву берут шпателем из разных мест. Берут две навески почвы по 10г (для микробиологического анализа и для определения влажности.)

Навеску почвы, предназначенную для микробиологического анализа, переносят в ступку (стерильную), увлажняют её предварительно простерилизованным физиологическим раствором и растирают пестиком 5 мин. Затем, количественно переносят навеску в чистую стерильную колбу вместе с физиологическим раствором. Все операции выполняют в боксе, вблизи от пламени спиртовки.

Затем пробку обжигают в пламени спиртовки и закрывают колбу. Колбу с суспензией круговыми движениями взбалтывают в течение 10 мин рукой или на качалке, которая дает более стандартное встряхивание. Необходимо следить, чтобы при взбалтывание не намокла ватная пробка.

После этого дают суспензии отстоятся в течение 30 секунд, чтобы осели крупные минеральные частицы, которые в дальнейшем будут затруднять поступление суспензии в пипетки, и приготовляют разведение почвенной суспензии для осуществления посева питательный агар. Разведения делают по такой схеме: Посев проводится из разведений 1:10, 1:100, 1:1000, 1: 10000, 1:100000 и т.д. в зависимости от группы учитываемых микроорганизмов, от типа почвы, сезона, влажности почвы. Наиболее точный подсчет получается если на чашке развивается 50-200 колоний бактерий и актиномицетов и 30-50 колоний грибов. При слишком густом или слишком разреженном посеве подсчет количества микроорганизмов будет очень не точным. При анализах почвы следует брать не менее 3-5 повторных образцов и каждый из них высевает на 3-5 повторных чашек для каждой из сред.

Из III-го, IV-го, V-го, разведения последовательно набираем стерильными пипетками суспензии. Пипетку держим в правой руке, а левой рукой осторожно приоткрываем крышку чашки Петри с застывшей средой и вносим одну каплю суспензии. Затем проводят шпатель через пламя горелки, остужают его о внутреннюю сторону крышки и растирают посевной материал по всей поверхности среды. Такой способ посева называются посев “газоном”. После инкубации посева появляются равномерный сплошной рост микроорганизмов.

“Засеянные” чашки Петри ставим в термостат при температуре 28⁰С.

При пересеве бактериальной культуры берут пробирку в левую руку, а правой, обхватив ватную пробку мизинцем и частью ладони, вынимают её, пронося над пламенем горелки. Удерживая другими пальцами той же руки прокаленную, петлю, набирают ею посевной материал, после чего закрывают пробирку пробкой, обжигая в пламени спиртовки. Затем в пробирку со скошенным агаром вносят петлю с посевным материалом, опуская её до конденсата в нижней части среды и зигзагообразным или прямым движением распределяют материал по скошенной поверхности агара. Вынув петлю, обжигают край пробирки и закрывают её пробкой. Петлю стерилизуют в пламени спиртовки и ставят в штатив. Такой метод посева называется посевом штрихом. Посев в столбик питательной среды делают бактериальной иглой, вводя её в центральную толщину – посев уколом.

Посев микрофлоры воздуха проводят следующим образом: чашку Петри с застывшей средой открывают и оставляют так на протяжении 30мин. После этого маркируют и помещают в термостат при температуре 28-30⁰С

Изучение микрофлоры воды: пипеткой на 1 мл отбирают пробу воды, и 1 каплю вносят на застывший агар в чашке Петри, затем распределяют шпателем по всей поверхности.

Контрольные вопросы

1. Что называется культивированием?

2. Чистые и накопительные культуры.

3. Что называется инкубацией?

4. Методика приготовления почвенной суспензии.

5. Как проводится посев почвенных разведений на твердую среду.

6. Как проводится посев штрихом и посев уколом.

Рекомендованный материал

1. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. Егоров Н.С. МГУ, М. 1995. Стр. 122-124.

2. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. «Спец.литература», С-Петербург. 1998. Стр. 107-110.

3. Медицинская микробиология. Гл. ред. Покровский В.И., Поздеев О.К. «ГЭОТАР Медицина». М., 1999. Стр. 996-1000.

4. Тимаков В.Д., Левашев В.С., Борисов Л.Б. Микробиология. «Медицина», М. 1983. Стр. 124-132.

5. Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии. «Колос», М. 1972. Стр.23-26.

 

ЗАНЯТИЕ 8